Os pequenos extratos nucleares para ensaios funcionais da expressão gênica Machineries

O objetivo geral do experimento a seguir é analisar a expressão gênica utilizando maquinarias nucleares funcionais extraídas de células. Isso é conseguido primeiro colhendo as células HeLa em meio de inchação. Em seguida, as células são rompidas por choque osmótico e então centrifugadas para formar um pellet de núcleos no terceiro passo.

Os núcleos são extraídos com sal, concentrados e submetidos à diálise para obter maquinarias solúveis e funcionais de expressão gênica. Em última análise, a funcionalidade dos extratos nucleares pode ser avaliada com base em suas atividades de transcrição e splicing, determinadas por meio de um sistema acoplado de RNA polimerase para transcrição e splicing. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a preparação de extrato nucleolar em massa, é que com este método pode-se utilizar uma pequena quantidade de células para preparar o extrato nuclear.

Inicie o procedimento semeando células HeLa em três placas de 150 milímetros com meio DMEM suplementado com soro bovino fetal (FBS) e antibióticos. Incube os cultivos em uma estufa a 37 °C com 5% de CO₂ até que as células atinjam 90% de confluência. Nesse momento, aspire o meio dos cultivos de células HeLa e lave-os uma vez com 13 mililitros de PBS à temperatura ambiente por placa. Em seguida, aspire o PBS, coloque cada placa de lado por alguns segundos e aspire o restante do PBS.

Em seguida, utilize um espátula para células para raspar as células até a borda inferior de cada placa e, então, transfira as células para um tubo Eppendorf de 1,5 mililitro. Por fim, pelotize as células em uma microcentrífuga por cinco minutos a cem vezes a gravidade (×g) e a quatro graus Celsius. Agora, aspire o PBS do pellet celular e estime o volume celular empacotado ou VCE observando a graduação no tubo.

Em seguida, adicione um volume duas vezes maior do tampão hipotônico em relação ao VCM ao pellet celular. Agite suavemente o tubo para ressuspender. As células devem ser pipetadas suavemente para cima e para baixo com uma pipeta de 1000 microlitros para desprender os agregados celulares, conforme necessário.

Em seguida, pelote as células nas mesmas condições de centrifugação anteriores. Após a centrifugação, aspire cuidadosamente a camada do tampão hipotônico. As células terão começado a inchar e o volume celular terá aumentado para cerca de 750 a 1000 microlitros.

Adicione novo tampão hipotônico até um volume final de 1,5 mililitro e reative as células no tampão. Novamente, incube as células reativadas e inchadas no gelo por 10 minutos enquanto as células esfriam. Enxágue um homogeneizador Dounce com tampão hipotônico e, em seguida, coloque-o no gelo junto com as células.

Em seguida, utilizando um lenço descartável delicado, como um lenço tipo Kim, seque o pistilo. Use uma ponteira de micropipeta estendida de 1000 microlitros para remover o tampão das downs. Agora, use a pipeta para transferir as células inchadas e resfriadas para a downs Down.

A parte mais delicada deste procedimento para obter sucesso é verificar a lise. Após cada etapa no microscópio, mova lentamente o pistilo ajustado da etapa para cima e para baixo cinco vezes para lisar as células, tomando cuidado para evitar bolhas. Em seguida, transfira uma alíquota de cinco microlitros da suspensão celular lisada para um tubo eppendorf e adicione 10 microlitros de azul de tripano e 15 microlitros de PBS 1x.

Adicione a solução celular a uma lâmina e examine as células ao microscópio óptico quanto à lise; os núcleos das células lisadas aparecerão azuis após três onças. A lise é insuficiente, pois são visíveis numerosas células vivas. Após cinco onças, há lise suficiente.

Finalmente, transfira as células lisadas para o tubo Eppendorf pré-resfriado e centrifugue a suspensão celular por cinco minutos em um microcentrífuga a 1500 × g e 4 °C. Em seguida, transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo sem perturbar o pellet. Agora, estime o volume nuclear da fração ou PNV observando a graduação no tubo.

Encha a ponta de uma pipeta micrométrica com tampão de baixa salinidade até a metade do VNP. Em seguida, insira a ponta da pipeta micrométrica nos núcleos na parte inferior do tubo einor. Lentamente, injete o tampão nos núcleos enquanto mistura suavemente.

Agite suavemente o tubo para garantir que o precipitado esteja completamente ressuspenso. Em seguida, adicione o tampão de alta salinidade na proporção de metade do volume de PNV e misture rapidamente uma única vez invertendo o tubo. Incube o tubo sob rotação por 30 minutos a quatro graus Celsius.

Por fim, centrifugue os núcleos na microcentrífuga por 15 minutos a 18.000 × g e 4 °C. Comece transferindo 500 microlitros do sobrenadante para microtubos gelados. Centrifugue o extrato nuclear de alta salinidade por 15 minutos a 14.000 × g e 4 °C; após a centrifugação, inverta o mini racon e coloque-o em um novo tubo EOR individual.

Após centrifugar por dois minutos a 1000 vezes G e quatro graus Celsius, o extrato nuclear de alta salinidade será concentrado para aproximadamente 115 microlitros. Agora, transfira alíquotas de 45 microlitros do extrato nuclear de alta salinidade para SLIs de diálise mini. Certifique-se de que a parte inferior da lâmina esteja alinhada com a parte inferior do flutuador.

Em seguida, coloque os SLIs em 500 mililitros de tampão de diálise gelado. Por fim, agite as alíquotas por uma a duas horas a quatro graus Celsius; o extrato nuclear apresentará aparência turva após a diálise. Esta figura mostra dados representativos comparando uma reação acoplada de transcrição pela RNA polimerase dois e processamento de RNA em um extrato nuclear em pequena escala versus um extrato nuclear em grande escala.

Quando o construto A-C-M-V-D-N-A foi incubado em extratos em larga escala ou em pequena escala, níveis semelhantes de pré-mRNA nascente foram sintetizados no ponto temporal de cinco minutos após a adição de alfa e manin para bloquear a transcrição adicional, e os intermediários de splicing e os produtos de splicing acumularam-se ao longo do tempo com cinética semelhante em ambos os tipos de extratos. Esses resultados representativos confirmam que as eficiências do sistema acoplado de transcrição pela RNA polimerase dois e splicing são semelhantes em extratos nucleares em larga escala e em pequena escala. Para demonstrar a utilidade do extrato em pequena escala, extratos foram preparados a partir de células HeLa tratadas com o inibidor de splicing E 7 1 0 7 ou com o composto controle negativo Platy analy F, e então um ensaio acoplado de transcrição pela RNA polimerase dois e splicing foi realizado conforme demonstrado nesta figura; a transcrição pela RNA polimerase dois ocorreu eficientemente em extratos preparados tanto a partir de células tratadas com plaid F quanto com E 7 1 0 7.

Em contraste, o splicing ocorreu normalmente no extrato preparado a partir das células tratadas com analy F, mas foi abolido nas células tratadas com E 7 1 0 7. Esses dados fornecem a prova de conceito para o uso de extratos nucleares em pequena escala após tratamento especial das células em pequena escala. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em menos de cinco horas.