Visualização melhorada de metástases pulmonares em Resolução única célula em Ratos por Combinado
21 de agosto de 2012
O protocolo romance relatado no presente estudo permite a detecção seletiva de metástases pulmonares em resolução única célula em camundongos combinado In-situ Perfusão pulmonar e fixação e coloração com X-Gal de LacZ Marcado com células tumorais.
O objetivo geral deste procedimento é melhorar a detecção de micrometástases no pulmão de camundongo ex vivo, preservando a arquitetura dos pulmões inflados. Isso é realizado primeiramente por meio da perfusão do pulmão in situ com PBS para remover o sangue, que é a principal fonte de fundo colorido nesse tecido. Os próximos passos consistem em inflar o pulmão pela injeção de PFA e, em seguida, pinçar para fixar o tecido pulmonar sob inflação.
Em seguida, o pulmão é removido e fixado novamente em PFA ou lóbulos pulmonares individuais são embutidos para criosecção. Os passos finais consistem em corar os tecidos em solução Xal e visualizar as células tumorais LA zag; por fim, metástases podem ser detectadas em lóbulos pulmonares inteiros ou em cortes de tecido pulmonar, até mesmo ao nível de célula única, utilizando um microscópio binocular ou um microscópio de luz. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a técnica de sky standing por si só, é que a detectabilidade de micrometástases é consideravelmente melhorada devido à remoção do fundo relacionado ao sangue.
Inicie o protocolo anestesiando um camundongo com uma injeção intraperitoneal de ketamina, xilazina e acepromazina em aproximadamente 150 microlitros de PBS. Quando os reflexos de dor do camundongo não forem mais observados, fixe-o na mesa cirúrgica. Retire e alise os pelos com etanol 70%.
Abra a pele do abdômen até o pescoço. Puxe a pele para os lados ou remova-a. Abra cuidadosamente o peritônio no tórax para evitar a ruptura de grandes vasos, como as veias jugulares.
Isso melhorará a eficiência da perfusão. Agora, corte a veia cava cardíaca abaixo do fígado usando uma seringa de 20 mililitros com uma agulha de 21 a 24 gauge. Injete lentamente 10 a 15 mililitros de PBS no ventrículo direito do coração em batimento até que o pulmão fique completamente branco e o coração pare de bater.
Em seguida, oclua os vasos sanguíneos acima do fígado e do diafragma com um prendedor vascular. Encha uma seringa de 10 mililitros com paraformaldeído a 3% e, com uma agulha de 21 a 24 gauge, injete no ventrículo direito. Aproximadamente dois mililitros.
Exponha a traqueia fora do tórax e infle o pulmão com uma injeção na traqueia de cerca de três mililitros de aldeído a partir da região externa ao tórax. Em seguida, imediatamente após a remoção da agulha, oclua a traqueia ao redor do local da punção com um clamp vascular e aguarde 10 minutos para permitir a fixação. Em seguida, seccione os vasos sanguíneos acima do clamp vascular.
Em seguida, remova o clamp e injete aproximadamente dois mililitros de PBS no ventrículo direito para remover o excesso de formaldeído a vácuo. Fure as partes inferiores de todos os lobos pulmonares com uma agulha e remova o clamp vascular da traqueia. Agora, injete três a cinco mililitros de solução de inclusão diluída na traqueia, ajustando em relação à outra injeção.
Interrompa a injeção quando o parafôrmico nos lóbulos pulmonares for substituído pela solução. Remova cuidadosamente o pulmão puxando o coração com uma pinça e seccionando os ligamentos de tecido conjuntivo, os vasos sanguíneos e a traqueia. Certifique-se de manter o coração conectado aos pulmões.
Reserve um lobo para cortes criostáticos e use o tecido pulmonar restante para coloração do pulmão inteiro. Coloque o pulmão em um copo plástico com tampa hermética e fixe com formaldeído 2% em PBS. Coloque um pedaço de gaze sobre o pulmão para mantê-lo submerso na solução e deixe em temperatura ambiente por 30 minutos.
Após meia hora, remova a solução de fixação e lave o tecido completamente com PBS por 3 vezes. Prepare frescamente a solução xal pronta para uso diluindo um mililitro da solução estoque de Xal, na proporção de 1 para 40, na solução básica de coloração e adicione pelo menos 10 mililitros dela ao copo. Mergulhe o pulmão com um pedaço de gaze. Fixe a tampa levemente para permitir a troca de ar e incube a 37 graus Celsius por três a cinco horas protegido da luz.
Após a incubação, remova a solução de xal. Lave os pulmões uma vez com PBS para remover o resíduo da solução de xal e adicione pelo menos 10 mililitros de paraformaldeído a 4% em PBS. O tecido está agora pronto para histologia e pode ser armazenado por longo prazo em PFA a 4% a quatro graus Celsius.
Comece preenchendo um terço de uma forma de inclusão com meio de inclusão poly forze não diluído. Em seguida, coloque o lobo pulmonar na forma e continue adicionando meio até que o lobo esteja completamente coberto. Evite cuidadosamente a formação de bolhas de ar e, em seguida, incube o lobo incluído a quatro graus Celsius por 20 minutos.
Em seguida, prepare os pulmões embutidos para o corte congelando-os lentamente em uma mistura de gelo seco e isopentano. Se necessário, eles podem agora ser transferidos para um congelador a menos 80 graus Celsius para armazenamento. Corte seções criostáticas de sete a 10 mícrons do lobo e monte as seções em lâminas comerciais prontas para seções criostáticas. Após o montagem, incube imediatamente as seções na solução de coloração XAL a 37 graus Celsius por 24 horas em uma câmara umidificada. No dia seguinte, lave as lâminas duas vezes com PBS, cinco minutos por lavagem.
A seguir, realize uma breve lavagem com água destilada. Agora contracolora as lâminas com vermelho nuclear rápido durante 10 segundos para obter uma contracoloração fraca que torna o xal mais dominante e, imediatamente, remova a contracoloração com água destilada. Para uma contracoloração mais intensa, prolongue o tempo até 30 segundos ou mais.
Monte as lâminas com imunomontagem. A formação de metástases nos modelos de OS murino LM oito foi reavaliada. Utilizando as imagens representativas descritas aqui de pulmões perfundidos e não perfundidos de camundongos injetados simultaneamente com células done e LM oito transduzidas com laxy e não transduzidas com controle, em camundongos injetados com células controle done.
Metástases macroscópicas e microscópicas permaneceram indetectáveis em pulmões não perfundidos e perfundidos. No entanto, de forma interessante, em camundongos injetados com células dun LA Z, a coloração xgl revelou focos micrometastáticos azuis de células isoladas ou pequenos aglomerados celulares na superfície dos pulmões não perfundidos. A perfusão e fixação in situ dos pulmões melhoraram ainda mais a detectabilidade das micrometástases dun la z. Contudo, não foi observado crescimento para focos macroscópicos em camundongos injetados com células controle LM oito. Focos macrometastáticos translúcidos, mal detectáveis, maiores que 0,1 milímetro de diâmetro, foram reconhecidos em pulmões não perfundidos. A perfusão do pulmão não melhorou a detecção desses focos.
No entanto, em camundongos injetados com células LAC Z ate, foram detectadas múltiplas metástases macroscópicas azuis por coloração com X-gal na superfície de órgãos não perfundidos. Metástases microscópicas também foram detectadas na superfície de órgãos não perfundidos. Além disso, a perfusão dos pulmões melhorou ainda mais a detecção de metástases macroscópicas e microscópicas.
Consequentemente, micro e macrometástases tornaram-se visíveis com maior densidade e em número maior, principalmente devido à transparência do tecido perfundido, no qual focos localizados sob a superfície do órgão também se tornaram visíveis. Uma análise histológica adicional utilizando cortes criostáticos de tecido pulmonar confirmou a detecção aprimorada de metástases pulmonares em camundongos injetados com células LAX Z transduzidas e células LM oito em camundongos com tumores primários derivados de células Dun LAX Z. Micrometástases ou até mesmo focos de célula única foram identificados em cortes pulmonares.
Isso não foi observado em camundongos com tumores primários das respectivas células controle. Além disso, as metástases macroscópicas também eram mais claramente visíveis em camundongos injetados com células LM oito LA C do que em animais com as células controle LM oito. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a perfusão e fixação pulmonar em ZI dois e a subsequente coloração exci das metástases nos pulmões ressecados.
Esta técnica é uma leitura altamente sensível do ponto final para a distribuição de metástases no pulmão em qualquer tipo de estudo de câncer e também pode servir como referência para a melhoria das técnicas atuais de imagem in vivo, como micro-TC, PET e RNM, utilizadas na detecção precoce de lesões metastáticas.
Visão Geral
Este estudo apresenta um novo protocolo para a detecção seletiva de metástases pulmonares com resolução de única célula em camundongos. O método combina perfusão pulmonar in situ, fixação e coloração com X-Gal de células tumorais marcadas com lacZ.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Oncologia
- Histologia
Contexto
- As micro-metástases no pulmão são difíceis de detectar devido ao fundo relacionado ao sangue.
- Os métodos existentes não possuem a capacidade de visualizar metástases com resolução de célula única.
- Técnicas aprimoradas de detecção são essenciais para uma melhor compreensão da disseminação tumoral.
- Este estudo tem como objetivo aumentar a visibilidade de micro-metástases em tecidos pulmonares.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo que permita a detecção de metástases pulmonares em nível de única célula.
- Preservar a arquitetura pulmonar durante o processo de detecção.
- Melhorar a detectabilidade geral de micrometástases em comparação com os métodos existentes.
Métodos Utilizados
- Perfusão in situ dos pulmões com PBS para remoção do sangue.
- Inflação e fixação do tecido pulmonar utilizando paraformaldeído.
- Embutimento e criosseccionamento dos lobos pulmonares para análise detalhada.
- Coloração com X-Gal para visualizar células tumorais marcadas com lacZ.
Resultados Principais
- Detecção aprimorada de micrometástases em pulmões perfundidos em comparação com controles não perfundidos.
- Células isoladas ou pequenos aglomerados de metástases foram identificáveis utilizando coloração com X-Gal.
- O protocolo reduz significativamente a interferência de fundo proveniente do sangue.
- Imagens representativas demonstram a eficácia do método.
Conclusões
- O protocolo desenvolvido é eficaz para detectar metástases pulmonares com resolução de célula única.
- Este método aprimora as técnicas existentes ao reduzir o ruído de fundo.
- Aplicações futuras podem aprimorar o entendimento da biologia tumoral e da metástase.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A detecção precisa de micrometástases é fundamental para estudos pré-clínicos em oncologia, pois a carga tumoral não detectada pode levar a sinais falsos negativos de eficácia e falhas dispendiosas em fases tardias. Este protocolo aprimora a validação de alvos ao permitir a visualização com resolução em nível de célula única de células tumorais marcadas com lacZ no tecido pulmonar, reduzindo a interferência de fundo proveniente do sangue. A sensibilidade aumentada apoia a redução de riscos mecanicistas e a confiança preditiva em modelos de metástase, orientando diretamente decisões de avanço ou interrupção no desenvolvimento terapêutico.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da visualização da carga de micrometástases com resolução em nível de célula única.
- Valor Operacional: Oferece um método de baixo custo e com pouca necessidade de equipamentos para a validação funcional de alvos em modelos de metástase.
- Valor Preditivo: Apoia a seleção de projetos ao revelar eventos metastáticos latentes ou precoces que passariam despercebidos pela imagem convencional.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Gera preparações teciduais padronizadas e reprodutíveis adequadas para pontuação quantitativa de metástases.
- Saída Quantitativa: A coloração com X-Gal produz um sinal cromogênico que permite a patologia digital e a contagem automatizada de células positivas para lacZ.
- Reutilização da Plataforma: O preparo de pulmão perfundido serve como uma plataforma reutilizável para triagem de compostos anticâncer em múltiplos estudos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Mantém a arquitetura alveolar e a morfologia tecidual, garantindo que a detecção de metástases reflita o microambiente pulmonar fisiologicamente relevante.
- Continuidade Translacional: Conecta a descoberta científica à validação pré-clínica, fornecendo leituras de metástases baseadas em histologia e consistentes.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Aumenta a confiança nos dados de eficácia pré-clínica, reduzindo a taxa de falhas devido à progressão metastática não detectada.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a otimização do composto líder, fornecendo um ponto final confiável ex vivo para a avaliação de metástase que complementa as modalidades de imagem in vivo.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir a visualização direta da disseminação e colonização de células tumorais no tecido pulmonar.
- Triagem: Fornece amostras de tecido padronizadas e com fundo reduzido para avaliação consistente de compostos em ensaios de metástase.
- Análises: Gera leituras quantitativas com resolução em nível de célula única, facilitando comparações estatísticas entre grupos tratados.
- Pesquisa Translacional: Garante fidelidade histológica para a extrapolação pré-clínica para clínica, preservando a estrutura pulmonar e o nicho metastático.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um protocolo padronizado e transferível para detecção de metástase em diversos programas de descoberta em oncologia.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em modelos de metástase ao reduzir a detecção falsa negativa devido ao fundo vascular.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e padronização entre laboratórios por meio de parâmetros definidos de perfusão, fixação e coloração.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao aumentar a confiabilidade dos dados pré-clínicos de metástase, reduzindo investimentos desperdiçados em candidatos ineficazes.
- Impacto no Portfólio: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco com base na avaliação precisa da carga de micrometástases.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em cirurgia de camundongo, técnicas de perfusão e processamento histológico.
- Depende do acesso a equipamentos de perfusão, criostato e ferramentas histológicas padrão (microscópios, moldes para inclusão).
- Necessita padronização entre equipes distintas, como farmacologia in vivo e histologia, para garantir o manuseio consistente dos tecidos.
- A adaptação a outros tipos de tecidos pode exigir otimização da pressão de perfusão e do tempo de fixação.
- Limitação prática: a sensibilidade da coloração com X-Gal depende dos níveis de expressão de lacZ e pode requerer amplificação do sinal em modelos com baixa expressão.
