Uma avaliação quantitativa da migração celular pelo ensaio Phagokinetic faixa Motilidade

O objetivo geral deste procedimento é poder medir quantitativamente a motilidade celular ao longo do tempo utilizando um ensaio de motilidade celular baseado em nanopartículas de ouro. Isso é realizado primeiramente preparando lamínulas de vidro para receberem um revestimento de nanopartículas de ouro. Especificamente, lamínulas livres de endotoxinas são revestidas com gelatina e depois submetidas à esterilização em estufa.

O segundo passo é reduzir o ácido cloraurico, o que criará nanopartículas de ouro e permitirá revestir uniformemente as lamínulas recobertas com gelatina usando a solução. Em seguida, as células são colocadas sobre as lamínulas recobertas com nanopartículas de ouro pelo tempo desejado do experimento. Prosseguindo, a gelatina deslocará as nanopartículas de ouro, criando trilhas.

O passo final é o monitoramento e a quantificação da motilidade celular utilizando microscopia para imagens dos trajetos criados pelas células em movimento. Em última análise, medições de área dos trajetos são realizadas usando software de acesso livre. Uma das principais vantagens desta técnica em relação aos métodos existentes, como a imagem de lapso de tempo, é que este ensaio requer apenas um microscópio óptico padrão, uma câmera padrão e utiliza software de imagem de acesso livre.

Além disso, o ensaio também permite facilmente a análise e comparação de múltiplas amostras utilizando um método capaz de triagem de alto rendimento. Embora este método possa fornecer informações sobre a influência de diferentes fatores fisiológicos e do movimento celular, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como nos estudos sobre os efeitos que patógenos exercem na motilidade de células infectadas. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades, pois o método exige que se sigam rigorosamente os volumes e temperaturas indicados no protocolo.

Neste protocolo, dá-se ênfase à avaliação da cor da solução final de nanopartículas de ouro precipitadas para garantir o sucesso. A demonstração visual deste método é fundamental, uma vez que as etapas do ensaio de motilidade cinética de FGO são difíceis de aprender.

Eles contêm vários procedimentos não comumente utilizados em laboratórios de biologia celular e molecular. Para preparar lamínulas revestidas com gelatina, primeiramente ressuspenda a gelatina em água desionizada para obter uma solução com concentração final de 0,5 gramas por 300 mililitros, em seguida submeta a mistura à autoclavação por 15 a 30 minutos. É importante realizar este procedimento dentro de duas horas após a adição da gelatina, em uma câmara de cultura de tecidos.

Prepare as lamínulas para revestimento transferindo primeiro oito a nove lamínulas lavadas com ácido para um recipiente plástico de 100 milímetros. Certifique-se de que as lamínulas não estejam em contato umas com as outras nem com as laterais do recipiente. Pipete cuidadosamente duas a três gotas de gelatina sobre cada lamínula, evitando transbordamento sobre a placa.

Em seguida, coloque a placa contendo as lamínulas revestidas com gelatina em uma estufa e aqueça a 90 graus Celsius por 10 minutos. Após 10 minutos, retire a placa da estufa e devolva-a para a capela de cultura de tecidos.

Aspire suavemente qualquer gelatina em excesso. Retorne a placa ao forno e seque as lamínulas a 70 graus Celsius por 45 minutos. Após as lamínulas estarem secas, remova a placa do forno e retorne-a para a câmara de cultura de tecidos.

Usando uma agulha estéril com delicadeza, levante um dos lados da lamínula. Em seguida, utilize pinças estéreis para remover as lamínulas revestidas com gelatina do recipiente e colocá-las em poços separados de uma placa de 24 poços. O próximo passo é preparar lamínulas revestidas com ouro coloidal.

Inicie preparando 10 mililitros de uma solução de citrato de sódio 0,5%, trabalhando em uma cabine de cultura de tecidos. Combine 1,5 mililitro da solução de ácido cloro-órico 14,5 milimolar e 13,5 mililitros de água desionizada autoclavada em um frasco erlenmeyer estéril e livre de endotoxinas. Para cada oito a nove lamínulas, o resultado deve ser uma solução levemente amarelada. O ácido cloro-órico é tóxico e deve ser manipulado com cuidado. Também é sensível à luz, portanto o passo de fervura deve ser realizado em ambiente com pouca luminosidade.

Quando a solução atingir seu ponto de ebulição, retire o frasco da placa aquecedora e transfira-o para uma placa de agitação. Para formar as partículas coloidais de ouro na solução, adicione 0,7 mililitros da solução de citrato de sódio a 0,5% a cada 15 mililitros da solução de ácido cloro-ORIC sob agitação, continuando a agitação por aproximadamente dois minutos. Durante esse período, a solução mudará de uma cor amarela pálida para incolor, depois para cinza, roxa e, finalmente, roxa-escura.

Antes de finalmente atingir uma cor de vinho tinto ou, de preferência, enferrujada, aspire a solução de ouro coloidal em uma pipeta de 10 mililitros e deixe a solução esfriar na pipeta por um a dois minutos, até atingir a temperatura ambiente. Em seguida, adicione 0,5 a um mililitro sobre as lamínulas recobertas com gelatina na placa de 24 poços. Coloque a placa de 24 poços contendo as lamínulas recobertas com ouro coloidal em um incubador a 37 graus Celsius e incube por 30 minutos. Após o tempo necessário para que as partículas se depositem sobre as lamínulas recobertas com gelatina, verifique sua densidade sob um microscópio de luz.

A distribuição apropriada de nanopartículas de ouro ajuda a distinguir de forma fácil e eficiente as bordas dos caminhões solares. A densidade ideal varia conforme o tamanho da célula. Uma concentração de partículas de ouro muito alta prejudica a capacidade das células de se moverem, enquanto uma concentração de ouro, partículas de ouro muito baixa limita a capacidade de delinear uma trilha precisa de motilidade.

Por esse motivo, somente lâminas de cobertura produzidas no mesmo lote ou que foram padronizadas para ter a mesma densidade devem ser usadas juntas em experimentos individuais. Se a concentração de partículas de ouro for insuficiente, adicione de 0,5 a um mililitro da solução de ouro coloidal às lâminas de cobertura revestidas com gelatina. No entanto, se a concentração de partículas de ouro for muito alta, como no caso mostrado aqui, a única opção eficaz é refazer a solução de ouro coloidal e revestir novas lâminas de cobertura.

Se a densidade de partículas estiver correta, devolva a placa ao incubador a 37 graus Celsius e incube por uma hora até a noite seguinte, enxaguando as partículas de ouro não ligadas mergulhando as lamínulas três vezes em solução salina tamponada com fosfato estéril. Em seguida, armazene as lamínulas revestidas com ouro coloidal em poços contendo PBS, em uma placa limpa de 12 poços, a quatro graus Celsius, até o momento de utilização. As lamínulas não devem secar e devem ser usadas dentro de dois a três meses a partir da data de preparo.

O próximo passo é preparar as lamínulas recobertas com ouro coloidal para o cultivo celular. Comece colocando-as em poços individuais de uma placa de 24 poços que já tenham recebido aproximadamente 0,3 mililitros de meio de cultura antes da adição das lamínulas. Transfira aproximadamente 5.000 a 50.000 células para cada lamínula recoberta com ouro coloidal. O número de células variará conforme o tipo celular, mas a densidade celular deve ser baixa o suficiente para evitar a sobreposição de trajetórias celulares de múltiplas células na mesma área.

Cubra a placa e coloque-a em um incubador a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por seis a 24 horas. Com base na motilidade do tipo celular, o intervalo de tempo ideal deve ser determinado experimentalmente para cada tipo celular. Após a incubação, fixe qualquer lamínula que não será analisada imediatamente, mergulhando-a duas vezes em PBS, seguido de incubação em paraformaldeído a 3% por 15 minutos à temperatura ambiente. Capture imagens das trilhas criadas por uma única célula em movimento em lamínulas não fixadas ou fixadas. A ampliação utilizada para tirar fotos das trilhas celulares varia conforme o tipo celular. No entanto, a mesma ampliação deve ser usada em cada estudo para permitir a comparação dos resultados.

Para monócitos, a ampliação de 40 x funciona bem utilizando softwares gratuitamente disponíveis, como Image, JNIH Image ou Image Tool, para determinar a área média de ouro coloidal removido por 10 a 20 ou mais células para cada amostra a partir das imagens capturadas. Aqui é mostrado o trajeto limpo de partículas de ouro coloidal por um único monócito não estimulado, obtido com uma objetiva de 40 x. Células não móveis criam trilhas características pequenas, com formato oval ou circular ao seu redor, o que indica um baixo nível de movimentação. Em contraste, células altamente móveis são caracterizadas por movimento direcional, formando trilhas alongadas e áreas totais maiores devido às suas formas irregulares.

Os trajetos celulares são melhor analisados utilizando a ferramenta de desenho livre no software Image J para delinear seu volume. Medições quantitativas de área podem então ser realizadas usando a ferramenta de medição no menu de análise do Image J. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de seguir rigorosamente os volumes e temperaturas indicados no protocolo, pois desvios podem influenciar fortemente os resultados finais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como criar lamínulas revestidas com gelatina, como preparar nanopartículas de ouro e lamínulas revestidas com nanopartículas de ouro, e como monitorar e avaliar quantitativamente o movimento celular utilizando microscopia de luz.

Não se esqueça de que trabalhar com soluções em ebulição em uma placa aquecedora, especialmente os vapores provenientes da solução em ebulição de fluoreto, ácido AIC e citrato de sódio, pode ser perigoso; precauções como trabalhar na capela e usar o bom senso devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.