Utilizando o rato como um BLT humanizado baseado Stem Modelo Gene Therapy célula tumoral

O objetivo geral do experimento a seguir é gerar camundongos portadores de um sistema imunológico humano modificado. Isso é alcançado primeiramente preparando o camundongo para cirurgia e, em seguida, carregando o trocarte com um fragmento de timo na segunda etapa. O Matrigel é misturado com células transduzidas CD34 negativas e CD34 positivas, e a mistura é então adicionada ao trocarte.

Em seguida, os constructos de matrigel são transplantados sob a cápsula renal. Em última análise, a rejeição dos tumores-alvo pelos linfócitos T CD8 geneticamente modificados pode ser monitorada por imagem por PET in vivo e por medições físicas do tumor. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como modelos totalmente imunodeficientes, é que este método permite o estudo do desenvolvimento de células-tronco humanas geneticamente modificadas dentro do timo humano e a subsequente avaliação da eficácia in vivo das linhagens derivadas. O procedimento será demonstrado por três técnicos de nossos laboratórios: Gregory Bristol, Bernard Levin e Sean Kim.

Neste diagrama esquemático, está ilustrado o modelo BLT modificado utilizado nestes estudos para a geração de camundongos quiméricos portadores de mart, um tipo específico de linfócitos T. O implante tímico é reconstruído a partir de células CD34 transduzidas e não transduzidas isoladas de um fígado fetal autólogo. Uma fração das células transduzidas é então congelada e injetada nos camundongos irradiados quatro a seis semanas depois.

Neste vídeo, demonstra-se a implantação do enxerto vivo após os animais ficarem letárgicos devido à anestesia. Comece raspando o lado esquerdo de cada camundongo, da anca ao ombro, entre o centro das costas e o abdômen. Após registrar o peso de cada animal, faça furos nas orelhas para numeração e injete subcutaneamente 0,3 mililitros de carprofeno em cada um dos ombros.

Em seguida, posicione os camundongos sobre seus lados direitos, voltados para a esquerda. Agora, lave o trocarte de uma agulha de implante de câncer de 16 gauge com ponta arredondada usando PBS. Usando uma pinça de ponta fina, adicione um pedaço de timo à placa contendo PBS e, então, segure o trocarte na posição horizontal com a haste.

Aspire o tecido logo na ponta. Deslizar o trocarte sob a cápsula renal e injetar o tecido é um dos aspectos mais desafiadores deste procedimento. Em seguida, peça ajuda a um auxiliar.

Use uma pipeta de deslocamento positivo de ponta fina para misturar cinco microlitros de matrigel frio em um tubo de células com agitação suave. Mantenha o trocarte na posição horizontal. Retire lentamente a haste enquanto o auxiliar pipeta o matrigel.

Misture no trocarte para cada camundongo. Primeiro, passe Betadine na pele nua do animal e depois remova com um lenço de isopropanol. Duas vezes, identifique o ponto mais escuro sob a pele, indicando a localização do baço.

O rim é encontrado cerca de cinco milímetros dorsalmente ao baço, utilizando pinças rombas para levantar a pele sobre o rim. Faça um corte de aproximadamente 15 milímetros de comprimento na pele, paralelo ao baço. Faça um corte semelhante na camada muscular do peritônio abaixo.

No macho, o rim deve ser diretamente visível. Basta comprimir o abdômen para fazê-lo protrair. Mantendo a pressão sobre o abdômen com a mão esquerda para manter o rim exposto, na fêmea, utilize primeiro um hemostato para segurar o ovário e, em seguida, puxar o rim para fora, ajudando a manter o órgão exposto fora do corpo.

Faça um pequeno orifício na extremidade posterior da cápsula renal e, em seguida, deslize o trocarte nesse orifício e ao longo do rim até que a abertura do trocarte esteja completamente coberta pela cápsula renal. Em seguida, usando o dedo mínimo da mão direita, injete o tecido. Agora, use o hemostato fechado para empurrar suavemente o rim de volta ao seu lugar.

Amarrar um ponto no peritônio com um laço duplo, puxando a pele para cima como uma bolsa, e depois aplicar dois grampos cirúrgicos no ferimento. Por fim, colocar uma gota de PBS em cada olho e deitar o camundongo de lado em uma gaiola sobre a cama de material de forração. Após implantar todos os camundongos da mesma maneira, confirmar que os animais voltaram a deitar de barriga para baixo antes de deixá-los.

Esta primeira figura mostra uma imagem representativa do implante vivo de TIM em camundongos humanizados. Nesta figura, observa-se o desenvolvimento normal do tecido tímico e a distribuição fisiológica dos linfócitos T positivos para CD quatro e CD oito humanos. Após a reconstituição, os animais possuem um sistema imunológico humano com distribuição normal de células T positivas para CD quatro e CD oito.

Aqui é mostrada uma imagem representativa de um camundongo portador de um tumor de melanoma. As áreas cinzas indicam a imagem da tomografia computadorizada (TC). As áreas coloridas indicam a atividade metabólica do tumor detectada pela tomografia por emissão de pósitrons (PET).

A tomografia computadorizada isoladamente neste experimento indicou uma grande massa tumoral na área indicada pelo círculo branco. No entanto, como a imagem PET in vivo ilustra, essa área consiste principalmente de tecido necrótico e cicatricial, destacando a utilidade da imagem PET como um método mais sensível e preciso para avaliar a regressão e a eliminação do tumor. Após este procedimento, outros ensaios, como fenotipagem de linfócitos T e ativação ex vivo, podem ser realizados para responder perguntas relacionadas à função dos linfócitos T.