Um procedimento otimizado para fluorescência-ativado Isolamento classificação celular (FACS) da Autônomo progenitores neurais a partir de vísceras de ratos fetais

O objetivo geral deste procedimento é obter uma população de progenitores neuronais purificados a partir de gânglios do sistema nervoso periférico. Isso é realizado primeiramente pela dissecação do órgão ou dos gânglios específicos de interesse em camundongos fetais. Os tecidos são então parcialmente dissociados para liberar as células individuais no meio circundante.

Em seguida, a suspensão celular é filtrada para remover eventuais coágulos residuais de tecido ou agregados grandes. Por fim, a suspensão celular é separada por citometria de fluxo para isolar a população de interesse com base na expressão de um marcador fluorescente nessa população celular. Em última análise, os padrões de expressão gênica podem ser comparados entre progenitores isolados em diferentes estágios de desenvolvimento ou entre populações purificadas de diferentes tipos celulares neuronais.

A principal vantagem desta técnica em relação ao isolamento de populações celulares com base em marcação por anticorpos é que frequentemente os reagentes imunológicos não estão disponíveis. Linhagens de camundongos geneticamente modificadas que produzem proteína fluorescente em subconjuntos discretos de neurônios permitem o isolamento dessas populações celulares, marcando células que expressam um gene específico. Embora demonstremos este método para o isolamento de progenitores neurais do intestino e da via neurogênica da boca, ele também pode ser aplicado a outros sistemas modelo que expressam repórteres fluorescentes.

Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque tendem a superdigerir os tecidos de origem, resultando em perda de viabilidade celular. Antes de iniciar a dissecação, observe os embriões por iluminação em campo claro para garantir que as estruturas relevantes estejam em foco. Em seguida, identifique os embriões positivos para o transgene mediante triagem da expressão do marcador fluorescente utilizando um microscópio estereoscópico de fluorescência.

Após a eutanásia, os embriões são iniciados adicionando-se uma quantidade mínima de PBS ao recipiente de dissecação, para que o embrião não flutue enquanto os tecidos são dissecados. Abra a pele do embrião ao longo dos lados do corpo e atravessando o abdômen ao nível do fígado. Vire o embrião de costas e use pinças finas para fixá-lo no lugar.

No nível da extremidade anterior, insira outro par de pinças ao nível do diafragma e, em seguida, puxe com rapidez. Puxe os órgãos internos em direção à cauda e afaste-os da parede corporal dorsal para remover as vísceras do fígado até o tubérculo genital. Se quaisquer órgãos da cavidade torácica, como o coração ou os pulmões, saírem aderidos às vísceras, remova-os antes de prosseguir.

Uma vez que as vísceras abdominais são separadas da carcaça, insira um par de pinças abaixo do fígado, próximo ao estômago, e delicadamente separe o fígado do intestino. Em seguida, dissecione cuidadosamente o intestino posterior da uretra dorsal e remova o intestino do trato urogenital. Por fim, vire o intestino de modo que o baço fique visível sob o estômago.

Remova o baço e o pâncreas. Separe os alças intestinais segurando o mesentério. Em seguida, retire o mesentério e a vasculatura associada do intestino puxando suavemente o mesentério.

Evite segurar o intestino diretamente com a pinça. Se o intestino se romper, basta reunir as partes separadas na etapa de dissociação. Reúna cada tipo de tecido em um tubo cônico de 15 mililitros contendo HBSS gelado, de acordo com o tipo de tecido e o tipo de fenótipo do embrião.

Após a centrifugação, subdisseque os tecidos e aspire o máximo possível de HBSS. Em seguida, re-suspenda o pellet tecidual em um a vários mililitros de ACU max. Troque as ponteiras de pipeta entre cada amostra.

Para evitar a contaminação cruzada entre tipos de tecidos, coloque os tubos em banho-maria a 37 graus Celsius por 20 a 45 minutos. Dependendo do estágio do tecido que está sendo isolado, a dissociação e filtração do tecido são as partes mais difíceis do procedimento, para evitar uma dissociação excessiva do tecido. E, como resultado, baixa viabilidade celular.

Limite o tempo de dissociação e não tente dissociar completamente todos os fragmentos de tecido pela metade. No final do tempo de dissociação, desagregue manualmente o tecido batendo vigorosamente o tubo contra a lateral do banho-maria e movendo rapidamente o tubo para baixo com um movimento de pulso brusco. Agora, transfira as amostras dissociadas para gelo e adicione imediatamente um mililitro de solução de contenção recém-preparada a cada tubo, utilizando uma ponteira nova para cada amostra; pipete a amostra para cima e para baixo até que o tecido esteja quase completamente dissociado.

Agora, utilizando uma pinça esterilizada com etanol, coloque um quadrado de 3 centímetros de membrana de malha de náilon de 38 mícrons sobre a boca de um novo tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, use ponteiras de diâmetro estreito para filtrar a solução celular individualmente ressuspendida através da malha, pipetando no centro da membrana. Após a filtração da suspensão celular, lave o tubo da amostra com um mililitro de quench 1 a 5 e filtre quaisquer células remanescentes.

Em seguida, remova a membrana tendo o cuidado de evitar que amostras de tecido não filtradas entrem no tubo. Após a centrifugação, aspire o sobrenadante das suspensões celulares e ressuspenda o pellet em um mililitro de quench um para cinco. Em seguida, filtre cada suspensão celular através de uma malha de náilon em tubos de poliestireno de cinco mililitros, conforme acabou de ser demonstrado.

Comece reservando uma pequena alíquota da amostra de fluorescência para o controle de compensação apenas EGFP. Em seguida, divida a amostra de tecido selvagem em duas porções, rotulando uma como selvagem apenas e a outra como sete A a d.Apenas. Agora, preencha todos os tubos de amostra com quench um a cinco e, após a centrifugação das amostras, aspire todo o sobrenadante, exceto os últimos 200 microlitros em cada tubo.

Por fim, adicione sete A a D às amostras a serem classificadas e ao controle contendo apenas sete A a D. Em seguida, adicione 0,75 mililitros de triazol LS a tubos microcentrífuga de 1,5 mililitro. Inicie a coleta das amostras utilizando as amostras controle para definir os parâmetros de compensação e as janelhas (gates), a fim de evitar células mortas positivas para sete A a D e coletar células que exibam alta intensidade de fluorescência GFP.

Após ajustar os parâmetros de compensação, inicie a classificação com a menor pressão possível, utilizando um bico de diâmetro largo e baixa taxa de fluxo. Colete um máximo de 25.000 células em cada tubo de microcentrífuga para que o triol LS não fique excessivamente diluído. Imediatamente após a classificação, vortex cada tubo de células capturadas no triol ls.

Nesta primeira figura, é mostrado um trato genital europeu inteiro montado a 15,5 dias pós-coito, visto ventralmente sob iluminação de campo claro. A mesma amostra é observada sob iluminação de fluorescência para demonstrar a distribuição de células positivas para EGFP nas glândulas adrenais e nos gânglios celíacos localizados medialmente, identificados pela expressão de seu transgene TH-EGFP. Esta vista lateral de uma bexiga subdissecada de um embrião TH-EGFP de 15,5 dias pós-coito mostra fluorescência decorrente da expressão do transgene nos gânglios pélvicos, na parede da bexiga e na uretra.

Nesta visão dorsal das mesmas células positivas para EGFP, observa-se claramente o tecido da uretra dorsal anterior. A dissociação tecidual para produzir suspensões celulares destinadas à triagem por fluxo representa um equilíbrio delicado entre uma digestão enzimática adequada e a evitação de superdigestão, que pode resultar em baixa viabilidade celular. Estas microfotografias mostram tecidos do trato urogenital inferior e intestinal na metade do tempo de dissociação. Como visto nestas fotos de tecido adequadamente digerido antes e depois da dissociação manual, pedaços triangulares de órgãos subdissecados ainda são claramente evidentes em tecidos tratados enzimaticamente por tempo excessivo ou em concentração muito elevada de enzima.

No entanto, a suspensão resultante não possui quaisquer fragmentos residuais de tecido; a dissociação adequada e a filtração manual produzem perfis de citometria de fluxo que normalmente exibem mais de 90% de células viáveis, e nessas células que expressam o marcador nessa população viável, a expressão de EGFP permanece de alta intensidade. A população preta é composta por células isoladas que estão mortas e marcadas pela captação do corante fluorescente seven a a d. A população cinza é composta por células singletas com base no espalhamento para a frente e lateral, que excluíram o seven a a d e, portanto, são viáveis.

A população verde provém da área positiva para GFP selecionada por gates e é composta por células viáveis únicas que excluíram sete A a d e que exibem fluorescência de EGFP. Com este procedimento, pode-se isolar progenitores neuronais de outros tecidos periféricos, como a cadeia simpática, a raiz dorsal, os gânglios ou o pulmão, com o objetivo de responder perguntas sobre diferenças em perfis de expressão gênica entre populações ou sobre o desenvolvimento de linhagens distintas.