Heterotípica tridimensional

O objetivo geral do experimento a seguir é gerar modelos tridimensionais típicos do desenvolvimento do câncer de ovário em estágio inicial. Primeiro, gere linhagens celulares imortalizadas H turt derivadas de tecidos epiteliais ovarianos normais primários e de fibroblastos. Em seguida, para recriar a arquitetura in vivo e as interações complexas entre células presentes no ovário, co-cultive linhagens celulares epiteliais e estromais em modelos de esferoides tridimensionais, prossiga com a fixação e coloração das culturas de organoides e analise a expressão de marcadores específicos, a fim de estudar as características moleculares das interações estromais e epiteliais.

Os resultados obtidos demonstram como alterações no compartimento de células estromais em modelos tridimensionais típicos podem influenciar o fenótipo de células epiteliais cultivadas em co-cultura. Modelos tridimensionais típicos podem ajudar a responder perguntas fundamentais na área de pesquisa do câncer de ovário, como explorar as origens dessa doença e elucidar o papel do microambiente estromal na iniciação e no desenvolvimento tumoral. As aplicações dessas técnicas estendem-se ao diagnóstico e à terapia de doenças, em comparação com outros métodos de cultivo tridimensional.

Essa técnica pode ser aplicada a uma gama mais ampla de volumes de cultivo celular e aplicações posteriores. Por exemplo, cultivos tridimensionais homotípicos e heterotípicos podem ser utilizados para testes de fármacos in vitro. Essa abordagem também pode ser aplicada a outros sistemas modelo, como no estudo de outros tipos de tumores sólidos ou em doenças benignas.

Transporte o tecido ovariano fresco para o laboratório de cultura celular em meio de crescimento para fibroblastos ovarianos normais imortalizados, suplementado com antibióticos e antimicóticos extras. Lave a amostra três vezes com cinco mililitros de PBS para remover quaisquer células epiteliais que permaneçam fracamente aderidas ao tecido. Em seguida, transfira a amostra com o PBS para uma placa de cultura P 100 limpa. Usando instrumentos estéreis, transfira o tecido para uma segunda placa de cultura P 100 seca e limpa.

Corte o tecido em pedaços de 0,5 centímetro quadrado e transfira cada pedaço para uma placa P 100 separada. Continue cortando o tecido em pedaços com menos de um milímetro quadrado de tamanho. Em seguida, adicione 20 mililitros de meio INOF GM e cultive, monitorando o crescimento celular por microscopia de contraste de fase.

Confirme que as células aderem à placa dentro de 24 horas. Monitore o crescimento celular utilizando microscopia de contraste de fase. Geralmente, as células aderem à placa dentro de 24 horas. Após uma semana, remova qualquer tecido não aderente por aspiração, reponha o meio e, posteriormente, troque o meio das culturas duas vezes por semana, entre uma e três semanas, quando as colônias celulares tiverem cerca de 500 micrômetros de tamanho.

Isole os clones utilizando triplicatas e discos de clonagem revestidos. A fim de confirmar células fibroblásticas a 100%. Plaque uma amostra da linhagem celular sobre lamínulas de vidro e realize coloração por imunofluorescência para um marcador fibroblástico, um marcador epitelial e um marcador de células endoteliais.

Um dia antes da transdução retroviral da passagem H Turt, isole as células de fibroblastos ovarianos normais de um único prato P 100 em três pratos P 100. O sobrenadante viral pré-fabricado pode ser adquirido comercialmente ou produzido internamente utilizando protocolos padrão de cotransfecção de células HEC 2 9 3 T. Para preparar a solução de poli-Hema, pese 1,5 grama de poli-Hema e coloque em um frasco estéril.

Adicione 95 mililitros de etanol absoluto grau biologia molecular e 5 mililitros de água destilada grau cultura celular. Coloque a solução de poli-Hema em banho-maria a 65 graus Celsius até dissolução completa. Revesta as placas de cultura de tecidos com a solução de poli-Hema recém-preparada.

Deixe secar ao ar as placas de cultura celular dentro da capela de fluxo laminar. Uma agitação suave em uma plataforma oscilante pode ser utilizada para garantir um revestimento uniforme de placas ou frascos de maior tamanho. Se a solução de poli-L-lisina secar muito rapidamente, a superfície não ficará lisa.

Se desejar, pré-trate os fibroblastos antes do cultivo 3D; por exemplo, para indução de senescência, trate as células com doses subletais de peróxido de hidrogênio. Recupere e expanda os cultivos de INOF e células epiteliais in vitro para preparar quantidade suficiente de células para o estabelecimento de esteroides heterotópicos 3D. Após uma lavagem com PBS de cinco minutos, adicione 15 mililitros de meio à placa de poli-hema.

Enquanto isso, adicione tripsina às células de fibroblastos ovarianos normais imortalizadas para destacá-las do recipiente de cultura. Após três a cinco minutos, neutralize a tripsina com um volume igual de meio de cultura e recolha as células por centrifugação. Suspender o pellet celular em cinco mililitros de meio e misture bem pipetando para cima e para baixo ou agitando suavemente.

Em seguida, utilize uma amostra de 10 microlitros para enumerar células viáveis usando trian blue. Agora, adicione 4 milhões de células INOF ao meio já distribuído na placa revestida com poli-hema. Complete o volume do meio de cultura até 20 mililitros e incube a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono.

Monitore a agregação celular em esferoides multicelulares por microscopia de contraste de fase para repor os cultivos de esferoides S a cada dois ou três dias. Incline as placas sobre uma pipeta. Deixe os esferoides sedimentarem e remova cuidadosamente cerca de 16 mililitros do meio exaurido com uma pipeta de cinco mililitros.

Adicione 16 mililitros de meio fresco à cultura e retorne à incubadora no dia sete. Crie culturas heterotípicas adicionando células epiteliais aos fibroblastos phe. Primeiro, prepare suspensões de células epiteliais ovarianas por tripsina, conforme descrito anteriormente, após a contagem celular.

Lave uma vez com meio GM INOF para evitar que quaisquer fatores de crescimento sejam transferidos do meio de crescimento epitelial. Após repor o meio das culturas de OID de fibroblastos, adicione as células epiteliais numa proporção de quatro para um, fibroblastos para células epiteliais. Os OID heterotópicos em GM INOF são reabastecidos tipicamente a cada dois ou três dias por um período adicional de 14 dias.

Para imunohistoquímica, fixe o PHE com formalina tamponada neutra, agregue o PHE e substitua a formalina por etanol 70%. Prossiga com o processamento em parafina utilizando protocolos padrão usados para tecidos humanos. Os esteroides emblocados em parafina podem ser seccionados e corados com hematoxilina e eosina ou com marcadores moleculares específicos utilizando imunohistoquímica.

Alternativamente, lave os esteroides em PBS e fixe em paraformaldeído a 4%. Em seguida, inclua as amostras em meio OCT e congele rapidamente para corte em criostato e coloração por imunofluorescência para análise por citometria de fluxo. Lave os esteroides em PBS e dissocie por digestão com tripsina ou Accutase a 37 graus Celsius.

A dissociação completa de esteroides em uma suspensão de células únicas pode ser promovida por pipetagem da solução para cima e para baixo com uma ponteira de pipeta de um mililitro. Tenha cuidado para não romper as células; neutralize a reação com um volume igual de meio de cultura e remova agregados celulares passando a suspensão por uma peneira celular de 40 a 70 mícrons. Em seguida, pelote as células, lave com PBS, conte-as, ressuspenda o número desejado de células em tampão facts e realize a coloração de acordo com as instruções do fabricante. Em nosso laboratório, transformamos parcialmente células epiteliais ovarianas e cultivamos essas células em co-cultura com fibroblastos ovarianos normais e senescentes para simular o desenvolvimento do câncer de ovário em estágio inicial.

Em um ovário pré-menopausado, a coloração por imunofluorescência de fibroblastos ovarianos normais imortalizados h hert mostra que tanto os fibroblastos ovarianos normais primários quanto os imortalizados expressam a proteína específica de fibroblastos, mas não expressam a citoceratina sete e expressam mentona. Células de fibroblastos ovarianos normais cultivadas isoladamente em 3D sobre PHE exibem uma morfologia fusiforme e abundante matriz extracelular. Aqui, os fibroblastos ovarianos normais foram expostos ao peróxido de hidrogênio para induzir senescência durante sete dias e, em seguida, cultivados com células epiteliais ovarianas parcialmente transformadas por 14 dias.

Para distinguir os dois tipos celulares, os esteroides resultantes foram imunomarcados para mim-1 como marcador de proliferação e para pan-citoceratina como marcador epitelial. A quantificação dos dados sugere que o microambiente envelhecido promove características neoplásicas de células epiteliais parcialmente transformadas, enquanto um microambiente normal inibe a progressão neoplásica, sendo que características histológicas de células normais e malignas, não detectáveis quando as células são cultivadas em monocamadas, são restauradas. Quando as células são transferidas para cultivo em esferoides, por exemplo, características histológicas de cânceres ovarianos de células claras podem ser detectadas em cultivos tridimensionais de linhagens celulares de câncer de ovário de células claras, mas não em cultivos em monocamada das mesmas células.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar culturas tridimensionais típicas para estudar as interações entre células epiteliais e estromais durante a gênese tumoral inicial. Ao estabelecer uma cultura 3D, é importante ajustar o número de células de acordo com a aplicação posterior, prevendo alguma perda de material durante o processamento.

Uma vez dominadas, as culturas tridimensionais podem ser estabelecidas em uma hora seguindo este procedimento. Outros métodos, como citometria de fluxo combinada com perfis de expressão gênica em micromatrizes, podem ser realizados para analisar as alterações globais na expressão gênica que ocorrem em culturas tridimensionais típicas, mas que não são detectadas sob condições de cultura em monocamada. Isso permitirá a análise das vias de sinalização bidirecionais que ocorrem especificamente em um microambiente de cultura tridimensional em núcleo.