Visualização das respostas toxina bacteriana induzida por microscopia de fluorescência de células vivas

O objetivo deste procedimento é visualizar as respostas de células imunes a toxinas bacterianas. Primeiro, a toxina é expressa e purificada a partir de células BL 21 gold. Após a confirmação da atividade e da concentração da toxina, ela é administrada às células imunes.

É realizada microinjeção e microscopia em células vivas de alta velocidade. A análise das imagens resultantes revela a cinética em tempo real das respostas das células imunológicas à toxina. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de imunologia, como o mecanismo de ativação do inflamassoma.

Embora este método possa fornecer informações sobre as respostas de células imunológicas mediadas por toxinas, ele também pode ser aplicado a outros estímulos, incluindo atratores quimiotáticos. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método ao estudar a interação entre bactérias e células imunológicas cultivadas e observamos interações altamente variáveis entre as bactérias e as células imunológicas. Inicie a purificação da estreptolisina O ou SLO com um cultivo de células BL 21 gold contendo PAG três SLO.

O plasmídeo dele foi cultivado até uma OD de aproximadamente 0,6. Para induzir a expressão proteica, adicione cinco mililitros de 20% de OSes ao cultivo e agite a 225 rpm em temperatura ambiente por três horas. Em seguida, transfira as bactérias para um frasco de centrífuga de 500 mililitros.

Em seguida, centrifugue a cultura a 12.000 × g durante 12 minutos a quatro graus Celsius; após a centrifugação, decante o sobrenadante. Armazene o pellet a menos 80 graus Celsius durante a noite ou por mais tempo, se necessário. Para purificar a SLO expressa, adicione 10 mililitros de tampão de lavagem ly suplementado com Triton X-100, lisozima e fenilmetilsulfonil fluoreto ao pellet congelado e pipete para cima e para baixo por cerca de 15 minutos.

Para ressuspender, suspenda o pellet mantendo a amostra em gelo. Transfira o pellet ressuspenso para um tubo cônico de polipropileno redondo de 50 mililitros. Sonique o lisado utilizando uma sonda de ultrassom a 40% de potência, cinco vezes por 30 segundos cada, com intervalos de 30 segundos e 30 segundos em gelo entre cada ciclo.

Em seguida, centrifugue o lisado sonicado a 39.000 ×g por 20 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, adicione o sobrenadante bacteriano a um mililitro de agarose de níquel NTA lavada. Incube a agarose de níquel NTA e o lisado juntos por 2,5 horas a quatro graus Celsius com agitação suave após a incubação.

Pelote as esferas centrifugando a 400 vezes G durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Observe que todas as demais lavagens e eluições são realizadas com essas condições de centrifugação, salvo indicação em contrário. Após a centrifugação.

Combine 30 microlitros do sobrenadante com 10 microlitros de tampão amostral SDS quatro vezes em um tubo de microcentrífuga e mantenha-o em gelo para análise de pureza. Em seguida, descarte o restante do agente sobrenadante e lave as microesferas quatro vezes com tampão de lavagem em tampão salino. E uma vez com tampão salino, centrifugando entre cada lavagem. A partir deste ponto, certifique-se de manter a amostra em gelo em todos os momentos.

A SLO é uma proteína muito sensível à redox e perderá rapidamente sua atividade se aquecida a 37 graus Celsius, mesmo que por um curto período de tempo. Para eluir a proteína SLO, adicione um mililitro de tampão de eluição e cinco microlitros de DTT um molar às microesferas, incube em gelo por 10 minutos. Em seguida, centrifugue e colete o sobrenadante em um tubo de centrífuga rotulado com o número de eluição.

Repita este processo três vezes e, em seguida, para esgotar endotoxinas da proteína SLO, adicione 200 microlitros de poli misturado lavado conjugado com agro-bolas, suspenso em tampão res salino, à amostra e agite a quatro graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, centrifugue a 10.000 ×g por um minuto a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, colete o sobrenadante em novos tubos de microcentrífuga rotulados.

Combine 30 microlitros de cada eluato com 10 microlitros, quatro vezes, de tampão amostral SDS. Para análise em gel de SDS-PAGE, mantenha as soluções de SLO em gelo. Determine as concentrações proteicas e a atividade hemolítica; se satisfatórias, recolha o SLOE em alíquotas de cinco a 10 microlitros, congele em gelo seco e armazene a menos 80 graus Celsius.

Em seguida, determine a lise específica. Reese. Suspenda as células a serem testadas em duas vezes. Centralize seis células por mililitro no tampão RB com 20 microgramas por mililitro.

Iodeto de propídio. Aqui, as células T 27 A são testadas. Adicione 100 microlitros de células a cada poço de uma placa de fundo em V de 96 poços em tubos microcêntrifugos separados.

Dilua seriamente o SLO para duas vezes a concentração final em tampão rb. Em seguida, adicione 100 microlitros de toxina ou 100 microlitros de tampão RB às células e incube por cinco minutos a 37 graus Celsius. As concentrações finais típicas variam de 2000 unidades por mililitro a 31,25 unidades por mililitro.

Execute as células em um citômetro de fluxo e colete os dados com filtros para fi, cethrin ou pe. Um deslocamento de um log representa células transitoriamente permeáveis, enquanto um deslocamento de três logs indica células mortas. Calcule a lise específica das células subtraindo a porcentagem de células mortas no controle daquela no experimento, utilizando a equação mostrada aqui um dia antes de semear os experimentos, centralizando duas vezes os cinco macrófagos em lâminas de vidro revestidas com colágeno.

Placas de 35 mm inferiores. O microscópio utilizado para a administração da toxina deve ser equipado com uma platina invertida, uma platina aquecida, cubos de filtros de excitação e emissão apropriados e, se disponível, uma lente Bertrand. A parte mais difícil deste procedimento é posicionar a agulha intacta até as células.

Para garantir o sucesso, utilizamos uma lente de Bertrand, normalmente usada para alinhamento, a fim de visualizar a agulha enquanto a movemos através dos planos focais. O microscópio deve estar conectado a um microinjetor e ser controlado por um computador com memória suficiente para coletar e armazenar dados, ligar o microscópio e o microinjetor e permitir que a platina aquecida alcance 37 graus Celsius enquanto se aguarda o aquecimento. Incube as células por 30 minutos com o corante a 37 graus Celsius.

Dependendo do ensaio, a marcação pode ser feita com cinco microlitros, quatro ou 2:00 AM em um mililitro de HBSS ou dois microlitros de cálcio am em um mililitro de meio completo aqui, sendo usado quatro ou dois. Remova o meio celular e lave as células uma vez com PBS. Aspire o PBS e substitua por um mililitro de RPMI suplementado com cloreto de cálcio a dois milimolares.

Monte a placa no microscópio, coloque as células em foco com campo claro e, em seguida, ajuste para focar ligeiramente acima das células. Em seguida, combine um microlitro da toxina SLO com quatro microlitros de DEXTRA 5 55 a 10 miligramas por mililitro e seis microlitros de água. Em seguida, centrifugue a 20.000 ×g durante 10 minutos a quatro graus Celsius.

A dextrana é usada para verificar se a ponta femto não está entupida com G. Use um microcarregador para carregar dois microlitros de toxina diluída na ponta femto a partir da parte traseira. Coloque a ponta femto no microinjetor.

Em seguida, ajuste o ângulo do injetor para que a ponta fique posicionada sobre o centro das células, com espaço para movimentação em todas as direções, e limpe as configurações anteriores do limite Z, que restringe até onde a ponta do microinjetor pode descer. Configure o microinjetor para injetar durante 0,5 segundos a 120 PSI com pressão de retorno de 20 PSI. Em seguida, abaixe a ponta até que ela entre no meio.

Usando a lente de Bertrand. Centralize a ponta e acompanhe-a enquanto ela é abaixada em direção às células. Assim que a agulha sair do foco, volte à óptica normal.

A sombra da agulha deve ser aparente no campo. Foque acima das células e abaixe a agulha até que entre em foco. Em seguida, coloque as células em foco e cuidadosamente aproxime a agulha de uma célula.

Após definir o limite Z para a injeção, inicie a aquisição de imagens e injete a toxina. Em seguida, levante a agulha e mova-se para uma nova região de células. Injete toxina adicional e continue a aquisição de imagens após a injeção.

Mova a agulha para a posição inicial para evitar qualquer vazamento indesejado de toxina pela agulha, utilizando o método descrito neste vídeo, de 10 à sétima até 10 à oitava unidades por mililitro. A SLO é tipicamente obtida com uma concentração proteica de quatro miligramas por mililitro. Este gel de eletroforese em SDS-PAGE mostra amostras bacterianas antes e depois da indução da toxina, após a purificação, e cada uma das três colorações com azul de comassie revela que a SLO induzida foi purificada com sucesso.

SLO é a banda de 69 quilodaltons utilizada para determinar a quantidade de toxina necessária para a lise de células T 27 A ou D duas. As células foram expostas a várias concentrações de SLO durante cinco minutos a 37 graus Celsius na presença de iodeto de propídio e analisadas por citometria de fluxo. A lise específica foi determinada conforme demonstrado aqui.

250 unidades por mililitro. O SLO provoca lise de 50% tanto das células T 27 A quanto das células D duas. Uma dose sublítica de 10% de lise do toxina seria de 62,5 unidades por mililitro.

Esses valores são importantes para estabelecer uma referência da atividade tóxica a fim de avaliar a morte celular após exposição ao toxina. Fibroblastos dérmicos humanos foram incubados com cálcio e homodímero de atherium utilizando um kit de células vivas e mortas da Life Technologies. Após exposição localizada à toxina bacteriana, antrolisina O. Nesta imagem, o cálcio é mostrado em verde e o brometo de atherium em vermelho; regiões próximas ao microbioma mostram morte celular caracterizada pela perda de cálcio e captação do homodímero de athe, enquanto regiões mais distantes da ponta não apresentarão danos.

A microentrega da toxina também permite a análise de eventos em tempo real, como o fluxo de cálcio. Essas DCs humanas carregadas com 4:02 AM foram expostas à SLO em uma taxa de fluxo constante, com simultânea aquisição de imagens vivas que mostrou mudança de verde para azul. A pseudocor indica um aumento nos níveis de cálcio citosólico.

O SLO induz um aumento rápido do cálcio citosólico, que se propaga pela região do recipiente devido à liberação localizada. No entanto, apenas as células próximas à ponta do microinjetor entram em contato com a toxina e reagem a ela. Isso demonstra tanto a resposta celular individual à toxina quanto a área espacialmente restrita de liberação da toxina, permitindo a resolução de eventos na dimensão zdi.

A microentrega foi combinada com microscopia confocal 3D de alta velocidade. Este conjunto de imagens mostra células dendríticas após a injeção de toxina. Elas foram pré-incubadas com anti-CD11c conjugado a PC, mostrado em verde, para marcar a membrana plasmática.

Como pode ser visto aqui, microvesículas são liberadas após a entrega da toxina. Como parte do processo de reparo celular, moléculas de toxina são concentradas em bolhas (blebs), que são destacadas para eliminar a toxina. Uma vez dominada, a microscopia pode ser realizada em 45 minutos.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter a toxina fria antes da mistura com as células e de testar a atividade hemolítica. Bom. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir a cinética em tempo real das respostas de células imunes a toxinas bacterianas utilizando microscopia de células vivas.