Compactas pontos quânticos para uma única molécula de imagem

O objetivo geral deste procedimento é preparar pontos quânticos fluorescentes com brilho e estabilidade otimizados, além de tamanho reduzido e ligação não específica mínima, para uso em imagem individual de moléculas. Isso é realizado primeiramente preparando núcleos pequenos de pontos quânticos de selênio de cádmio. O segundo passo é ligar esses núcleos com mercúrio para deslocar sua fluorescência para o espectro vermelho e aumentar seu brilho.

Em seguida, uma fina camada de liga é crescida sobre os nanocristais para estabilizar sua emissão fluorescente. O passo final consiste em transferir essas partículas de solventes orgânicos para tampões aquosos utilizando um polímero multidentado, que pode ser modificado com polietileno glicol biologicamente inerte. Por fim, espectrometria de fluorescência, cromatografia em gel e eletroforese em gel são utilizadas para demonstrar que essas partículas apresentam fluorescência intensa, tamanho hidrodinâmico compacto e carga eletrostática neutra — características adequadas para imageamento de fluorescência de molécula única em biologia.

A principal vantagem desses pontos quânticos em relação aos materiais comerciais existentes é que essas nanopartículas apresentam um tamanho hidrodinâmico significativamente reduzido. Embora pontos quânticos menores sofram impacto negativo devido à diminuição da intensidade de fluorescência, à menor estabilidade da fluorescência e à emissão de fluorescência apenas no espectro azul, compensamos esses efeitos utilizando um processo de troca catiônica de mercúrio. Esses nanocristais podem ajudar a responder perguntas fundamentais em biofísica e sinalização celular, permitindo a imagem dinâmica de biomoléculas individuais em ambientes biológicos densamente povoados.

Para começar, prepare uma solução 0,4 molar de selênio em THF adicionando selênio a um balão de 50 mililitros com três pescoços, evacuando o balão sob vácuo elevado e preenchendo com argônio usando uma linha de Schlenk em condições livres de ar. Adicione 10 mililitros de THF e aqueça a 100 graus Celsius sob agitação por uma hora para obter uma solução incolor e límpida.

Resfrie a solução até a temperatura ambiente e coloque o frasco de lado. Além disso, prepare uma solução de óxido de cádmio TDPA e ODE em um frasco de 250 mililitros com três bocas, utilizando as quantidades indicadas no protocolo escrito. Concomitantemente a este vídeo, evapore a solução utilizando uma linha de vácuo sob agitação.

Aumente a temperatura até 100 graus Celsius e mantenha em vácuo por mais 15 minutos. Para remover impurezas de baixo ponto de ebulição sob gás argônio, aqueça a mistura até 300 graus Celsius durante uma hora para dissolver completamente o óxido de cádmio. A solução mudará de uma cor avermelhada para incolor e transparente; resfrie a solução até a temperatura ambiente.

Em seguida, adicione HDA à solução de cádmio, aqueça até 70 graus Celsius e faça a evacuação. Após atingir uma pressão constante, aumente a temperatura e mantenha a solução em refluxo por 30 minutos. Mude a válvula da linha schlenk para gás inerte e insira o termopar diretamente na solução.

Em condições livres de ar, adicione DPP à solução de cádmio e aumente a temperatura até 310 graus Celsius. Agora, utilize uma seringa plástica descartável acoplada a uma agulha de calibre 16 para retirar 7,5 mililitros da solução superior de selênio 0,4 molar. Uma vez que a temperatura se equilibre a 310 graus Celsius, ajuste o controlador de temperatura para zero grau Celsius e injete rapidamente a solução superior de selênio diretamente na solução de cádmio.

A solução mudará de incolor para amarela, laranja, e a temperatura cairá rapidamente e aumentará novamente para aproximadamente 280 graus Celsius. O passo mais difícil neste procedimento é injetar todo o volume da seringa o mais rapidamente possível na solução de cádmio. Isso garante que as partículas nucleiem de forma homogênea.

Após um minuto de reação, remova o frasco do manto aquecedor e resfrie rapidamente com um jato de ar até que a temperatura fique inferior a 200 graus Celsius. Quando a temperatura atingir aproximadamente 40 graus Celsius, dilua com 30 mililitros de hexano; a maior parte do precursor de cádmio restante irá precipitar da solução. Remova este precipitado por centrifugação.

Em cada um dos seis tubos cônicos de centrífuga de polipropileno de 50 mililitros, dilua 12 mililitros da solução bruta resultante de nano Krystal com 40 mililitros de acetona. Após a centrifugação com os mesmos parâmetros, remova cuidadosamente e descarte o sobrenadante. Em seguida, dissolva os películas de nano krysttal em hexano.

Extraia a solução com um volume igual de metanol, retendo a fase superior. Repita essa extração mais duas vezes para a terceira extração. O volume de metanol pode ser ajustado para aproximadamente 15 mililitros para obter uma solução concentrada de hexano contendo pontos quânticos de seleneio de cádmio puros na concentração de aproximadamente 200 micromolar.

O rendimento típico desta reação é de três micromolares de cristais de selineto de cádmio com um diâmetro de dois a três nanômetros. Determine o diâmetro e a concentração dos nanocristais medindo o espectro de absorção no ultravioleta-visível conforme descrito no procedimento escrito. Os nanocristais podem ser parcialmente trocados com mercúrio para deslocar para o vermelho a absorção e a emissão de fluorescência. Para isso, em um vial de vidro de 20 mililitros com barra de agitação, misture hexano e clorofórmio, depois adicione a solução de pontos quânticos de selineto de cádmio, OLA e octanoilato de mercúrio. Após purificar os nanocristais e determinar sua concentração conforme descrito no procedimento escrito, deixe os nanocristais envelhecerem por pelo menos 24 horas à temperatura ambiente para o crescimento da camada.

Prepare soluções precursoras da camada 0,1 molar em frascos de 50 mililitros com três bocais sob vácuo; aqueça as soluções dos precursores de cádmio, zinco e enxofre até refluxão por uma hora para obter soluções claras, em seguida carregue com argônio em um frasco de três bocais. Adicione o ODE topo e os pontos quânticos de selênio de mercúrio e cádmio preparados. Evapore o hexino à temperatura ambiente utilizando a linha lateral.

Aumente a temperatura até 100 graus Celsius e mantenha em refluxo por 15 minutos. Altere a válvula da linha para gás argônio e insira o termopar na solução de nano Krystal. Após aumentar a temperatura até 120 graus Celsius, adicione 0,5 monocamadas ou 140 microlitros de solução precursora de enxofre e deixe a reação prosseguir por 15 minutos.

Aumente a temperatura para 140 graus Celsius. Adicione 0,5 monocamadas ou 140 microlitros de solução precursora de cádmio e deixe a reação prosseguir por 15 minutos. Em seguida, adicione 500 microlitros de OLA anidro à solução de reação.

Adicione 160 graus Celsius, adicione 0,5 monocamadas ou 220 microlitros de solução precursora de enxofre, seguido por uma quantidade igual de solução precursora de zinco a 170 graus Celsius, com intervalos de 15 minutos entre cada adição. Em seguida, a 180 graus Celsius, adicione 0,25 monocamadas ou 150 microlitros de solução precursora de enxofre e solução precursora de zinco em intervalos de 15 minutos. Resfrie. A solução até a temperatura ambiente e um novo coeficiente de extinção para essas partículas.

Utilizando um espectro UV-vis, assumindo que o número de nanocristais não tenha mudado, armazene a solução da reação como uma mistura bruta em um congelador. Nesta etapa, os nanocristais podem ser caracterizados por microscopia eletrônica, espectroscopia de absorção UV-vis e espectroscopia de fluorescência. Adicione pontos quânticos com núcleo e camada purificados a um balão de três bocas de 50 mililitros e remova o hexano sob vácuo alto.

Para obter um filme seco, preencha o frasco com argônio. Adicione purina anidra ao filme de nanopartículas e aqueça a suspensão a 80 graus Celsius ao longo de uma a duas horas. As nanopartículas se dissolverão completamente.

Adicione um mililitro de glicerol FIO 1 ao meio e agite a 80 graus Celsius por duas horas. Após resfriar o meio à temperatura ambiente, adicione 0,5 mililitros de trietilamina para desprotonar o tioglicerol e agite por 30 minutos. O meio pode ficar turvo após a adição de trietilamina devido à baixa solubilidade dos nanocristais polares nesta mistura de solvente.

Transfira a solução de pontos quânticos para um tubo cônico de centrífuga de 50 mililitros contendo uma mistura de 20 mililitros de hexano e 20 mililitros de acetona e homogeneíze bem. Isole os nanocristais precipitados por meio de centrifugação, seguida de lavagem do pellet com acetona, dissolva o pellet de pontos quânticos em cinco mililitros de DMSO com sonicação em banho ultrassônico e proceda com centrifugação. Para remover possíveis agregados, determine então a concentração de nanopartículas a partir de um espectro de absorção UV-VIS.

A solução de pontos quânticos puros deve ser utilizada dentro de três horas, pois a superfície pode oxidar lentamente sob condições ambientes no ar. Dilua a solução de pontos quânticos até 10 micromolar ou menos com DMSO e transfira para um balão de 50 mililitros. Adicione, gota a gota, sob agitação, uma solução preparada de ácido poliacrílico dilatado a cinco miligramas por mililitro em DMSO à solução de pontos quânticos e desgaseifique a solução à temperatura ambiente por cinco minutos.

Purgue a solução polimérica de pontos quânticos com argônio e aqueça a 80 graus Celsius por 90 minutos. Após resfriar a solução à temperatura ambiente, adicione um volume igual de ácido sódico 50 milimolar pH oito gota a gota e agite por 10 minutos. Purifique os pontos quânticos conforme descrito no procedimento escrito e determine a concentração a partir de um espectro de absorção UV-vis em um vial de vidro de quatro mililitros com barra de agitação; misture um mol de pontos quânticos em tampão borato com um excesso molar 40.000 vezes de polietilenoglicol monoamino de 750 Dalton.

As instruções podem ser encontradas no procedimento escrito sobre como adicionar funcionalidade química específica aos nanocristais. Adicione rapidamente um excesso molar de 25.000 vezes de uma solução recém-preparada do agente ativador à solução de pontos quânticos e agite à temperatura ambiente por 30 minutos. Repita este passo mais quatro vezes para saturar a superfície do nanocristal com PEG.

Finalmente, adicione 200 microlitros de tampão tris um molar para interromper a reação antes de purificar os nanocristais utilizando filtros centrífugos de diálise ou ultracentrifugação. Os nanocristais resultantes podem ser analisados quanto à monodispersão, tamanho hidrodinâmico e carga superficial utilizando cromatografia líquida, eletroforese em gel e microscopia de fluorescência. É mostrado aqui um espectro representativo de absorção e fluorescência para nanocristais de selênio de cádmio, nanocristais de selênio de mercúrio e cádmio após troca catiônica, e nanocristais de núcleo de selênio de mercúrio e cádmio com camada externa de sulfeto de cádmio e zinco após o crescimento da camada. Os nanocristais de núcleo de selênio de cádmio apresentam um rendimento quântico de fluorescência próximo a 15%. No entanto, essa eficiência cai para menos de 1% após a troca com mercúrio, provavelmente devido a armadilhas para portadores de carga introduzidas pela perturbação dos átomos superficiais.

O crescimento de uma fina camada de sulfeto de cádmio zinco aumenta essa eficiência para mais de 70%, a qual é amplamente mantida após a transferência para água. Em contraste, nanocristais com núcleo de selineto de cádmio e camada externa de sulfeto de cádmio zinco, sem incorporação de mercúrio, perdem uma fração substancial de seu rendimento quântico na água, a menos que uma camada externa espessa seja formada. É importante observar que a passivação com sulfeto de cádmio zinco desloca os espectros para o vermelho devido ao vazamento dos portadores de carga eletrônica para o material da camada externa.

Esse deslocamento é de cerca de 20 a 30 nanômetros para núcleos de cádmio e aumenta com o aumento do teor de mercúrio no núcleo. Assim, ao incorporar mercúrio no nanocristal do núcleo, o tamanho reduzido do nanocristal pode ser mantido sem prejuízo do brilho. O tamanho reduzido é demonstrado nesta micrografia eletrônica de transmissão e na distribuição do tamanho de partículas de nanocristais de núcleo de mercúrio, cádmio, selênio e invólucro de sulfeto de cádmio e zinco, mostrando um diâmetro médio de 3,2 ± 0,6 nanômetros.

A utilização de uma transferência de fase em duas etapas para a água é essencial para obter uma população homogênea de nanocristais que não exija classificação adicional por tamanho para remover aglomerados e agregados por exclusão de tamanho. O cromatograma representado aqui confirma que o tamanho é semelhante ao da albumina sérica. Em 75 kilodaltons e após modificação com PEG amino de 750 Dalton, o tamanho aumenta para apenas 12 nanômetros, semelhante ao de um anticorpo IgG.

A modificação com PEG neutraliza a carga superficial, conforme confirmado no experimento de eletroforese em gel de agarose apresentado aqui, em que o poço é marcado com uma seta e as polaridades dos eletrodos estão indicadas à direita, mostrando que, antes da conjugação, os nanocristais migram como partículas iônicas, enquanto os nanocristais pegilados são eletrostaticamente neutros. É mostrada aqui uma micrografia de epifluorescência desses nanocristais depositados sobre uma lamínula de vidro e excitados com luz visível de 545 nanômetros. Esses nanocristais são facilmente observados ao nível de molécula única a 30 quadros por segundo com uma câmera CCD de multiplicação eletrônica.

Este gráfico mostra que o número de partículas fluorescentes observadas em cada quadro flutua ao longo do tempo com excitação contínua. Isso se deve a uma combinação de intermitência e degradação foto-oxidativa. A intermitência predomina nos primeiros sete minutos, antes que a degradação foto-oxidativa se torne lentamente aparente.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como sintetizar quanticamente pontos quânticos por via química, como transferi-los para tampões aquosos e como modificá-los para aplicações em bioimagem. Não se esqueça de que o trabalho com reagentes contendo cádmio e mercúrio pode ser extremamente perigoso, e precauções extras devem ser tomadas para prevenir exposição pessoal.