Duas e três dimensões imagens de células vivas de Proteínas de DNA resposta a danos
28 de setembro de 2012
Este protocolo descreve um método para a visualização de um DNA double-strand proteína quebra de sinalização activada em resposta a danos no ADN, bem como sua localização durante a mitose.
Esta demonstração utiliza imagens de células vivas em 2D e 3D para compreender as relações espaciais e temporais das proteínas envolvidas na resposta ao dano no DNA. Primeiro, transfete ou transduza sua linhagem celular de escolha com construtos de expressão contendo marcadores fluorescentes apropriados. Aqui, M Cherry e GFP, em seguida, adquira uma série de vídeos controle mostrando as células marcadas fluorescentemente em condições normais.
Em seguida, aplique um tratamento apropriado e capture dados dos efeitos do tratamento no processo das células fluorescentes e analise os dados de vídeo para identificar as relações espaciais e temporais das proteínas. Em última instância, a microscopia de fluorescência em tempo real pode detalhar dinâmicas celulares, como a formação de focos de 53 BP1 em resposta a agentes danificadores do DNA ou o comportamento do 53 BP1 durante a mitose. Começamos a nos interessar por imagens em 2D e 3D quando desejamos estudar como diferentes tratamentos afetavam a mitose em determinadas linhagens celulares.
Essa abordagem experimental permite estudar a resposta ao dano no DNA e a manutenção da estabilidade genômica mais facilmente do que os métodos tradicionais. Além disso, é possível utilizar este método para estudar como certas proteínas interagem em diversas vias de sinalização e em diferentes linhagens celulares. A principal vantagem da imagem em tempo real em relação a técnicas tradicionais como a citocitoquímica é que ela permite o estudo das proteínas da resposta ao dano no DNA em tempo real.
Otimizar as condições corretas de gravação pode ser desafiador. Esta demonstração pode ser utilizada para observar os diversos pequenos passos necessários para garantir o sucesso. Lembre-se de que a persistência compensa quando se trata de minimizar o desbotamento fotográfico, encontrar os intervalos adequados de gravação e a duração ideal da gravação, entre outros.
Transfecte ou transduza as linhagens celulares apropriadas com os plasmídeos para expressão das proteínas de fusão mCherry e GFP. Mantenha as culturas sob seleção com droga e verifique periodicamente a expressão das proteínas fluorescentes no dia anterior à aquisição de imagens. Recolha as células utilizando tripsina.
Em seguida, semeie culturas de baixa densidade em placas de fundo de vidro com diâmetro de 3,5 centímetros. Este protocolo foi desenvolvido utilizando o microscópio confocal de disco giratório Zeiss Cell Observer SD, equipado com um suporte Axio Observer Z1. Primeiro, verifique se o gás CO₂ está sendo fornecido ao módulo de CO₂ do sistema de incubação. Se o microscópio estiver apoiado em uma mesa antivibratória Airtable, ligue então a fonte de ar para a Airtable.
Agora ligue a alimentação para a unidade de disco giratório do microscópio, câmeras, módulos de incubação, iluminador HXP, estágio motorizado, laser argônio e computador. Ligue as chaves para as linhas do laser que serão utilizadas. Inicie o software Axio Vision.
O software Avision pode ser personalizado com janelas e menus suspensos específicos para o microscópio e os componentes que ele controla. Assim, cada interface de usuário pode ter uma aparência única. Aproximadamente uma hora antes da aquisição de imagens, localize os controles do incubador e ligue o aquecimento para a câmara superior e para a placa da platina.
Defina a temperatura em 37 graus Celsius. Ligue o controle de CO2 e ajuste o nível em 5%. Selecione a lente objetiva para a aquisição de imagens neste estudo. A lente objetiva exige o uso de um meio de imersão com índice de refração semelhante ao da água.
Se for necessário imaginar múltiplas posições durante longos períodos de tempo, certifique-se de aplicar meio de imersão suficiente para que o microscópio não seque. Coloque a placa de cultura na platina e eleve a lente objetiva até o contato com a parte inferior, utilizando os controles do microscópio ou o software. Direcione a luz emitida para as oculares e selecione o conjunto de filtros de campo amplo apropriado para o sinal fluorescente de interesse.
Agora, observe através das lentes oculares. Foque a imagem e localize um campo adequado de células utilizando o software ou os controles do microscópio. Direcione a luz emitida para longe das oculares, direcionando-a para a porta com a unidade de disco giratório confocal no software.
Ligue o laser apropriado para este estudo. Para cada canal, ajuste a intensidade do laser regulando o controle do filtro óptico sintonizável kuo a um nível apropriado. Em seguida, selecione o espelho dicróico e os filtros de emissão adequados.
Abra o obturador da unidade de disco giratório. Agora, selecione a janela ao vivo para exibir o campo de visão atual. Em seguida, abra a janela de controle da câmera.
Selecione a câmera a ser utilizada e defina o tempo de exposição em aproximadamente 100 milissegundos. Ajuste a porcentagem e o ganho EM conforme necessário. Além disso, abra o controle da unidade de disco giratório confocal e ajuste a velocidade do disco giratório inserindo o tempo de exposição da câmera que foi definido para capturar uma imagem adequada.
Clique em definir para confirmar a alteração. Agora, abra a janela de aquisição multidimensional. Selecione a guia de canal e carregue ou selecione os canais apropriados definidos para o Flora Fours.
Para garantir o registro de imagens, utilize um espelho dicróico comum para ambos os canais. Configure o software para foco automático. Prossiga para a janela MDA e clique na guia ZS stack.
Selecione a pilha ZS na posição de foco atual. Defina o intervalo para uma pilha Z de 10 mícrons e escolha o número ideal de etapas para garantir a amostragem de Nyquist ao longo do eixo Z. Agora, clique em iniciar e analise a imagem da pilha Z resultante. Selecione a aba de tempo.
Defina o intervalo entre os pontos de tempo de aquisição de imagens e a duração total da sessão. Para a aquisição de imagens em múltiplos pontos de várias células na placa, abra a janela MDA. Selecione a guia de posição e verifique se a opção aplicar configuração antes ou após o ponto de tempo por posição está marcada.
Agora selecione marca. Localize utilizando a visualização ao vivo, mova o prato e selecione os campos de visão apropriados. Clique em iniciar no menu de aquisição multidimensional para começar o experimento e gravar um vídeo de controle.
Prossiga adicionando o tratamento apropriado e registre o vídeo experimental em intervalos de tempo determinados por um período definido. Para esta linhagem celular e para monitorar todo o processo de mitose, utilizamos um intervalo de sete minutos e meio durante quatro a cinco horas. Você precisará determinar as configurações específicas para sua linhagem celular e para o que deseja estudar.
Abra o software Velocity, crie e nomeie uma nova biblioteca e importe os arquivos de vídeo experimentais para visualizar os arquivos. Tente usar a configuração de foco estendido, ajustando os vídeos conforme necessário. O Velocity possui uma variedade de ferramentas para ajudar a melhorar a qualidade das imagens adquiridas.
Se as configurações do microscópio forem apropriadas, isso economizará muito tempo posteriormente na edição. Muitas vezes, é útil equalizar suas imagens e ajustar o brilho e o contraste, pois suas necessidades específicas variarão conforme seu experimento. Para visualizar as células em 3D, alterne para a configuração de opacidade 3D.
Isso permite a rotação das células renderizadas em 3D no espaço, proporcionando assim múltiplas perspectivas das estruturas de interesse dentro das células. Filmes. Imagens fixas podem ser exportadas para diversos tipos de arquivos conforme preferência do usuário. Em comparação com os controles, células de fibroblastos expostas à CPT formaram focos entre cinco e dez minutos e mantiveram esses focos durante todo o período de gravação.
Curiosamente, em células renais embrionárias humanas, a 53BP1 se dissocia da cromatina no início da mitose, formando uma leve névoa ao redor dos cromossomos em condensação. À medida que a telófase ocorre e a mitose chega ao fim, a 53BP1 novamente se agrega em focos distintos. Esperamos que este vídeo permita que você estude as relações espaço-temporais de proteínas envolvidas na resposta ao dano do DNA, bem como em outras vias.
Por exemplo, no campo da dinâmica da cromatina, esta técnica foi utilizada para estudar como a ligação da 53 BP1 afeta o movimento das extremidades teloméricas do DNA. Após a criação de células geneticamente modificadas, a microscopia de células vivas em duas e três dimensões pode ser realizada em aproximadamente quatro a oito horas. Certifique-se de que as configurações do microscópio sejam ajustadas adequadamente para obter uma imagem ideal.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para visualizar uma proteína sinalizadora de quebra de dupla fita do DNA ativada em resposta a danos no DNA, bem como sua localização durante a mitose. A demonstração utiliza imagens de células vivas em duas e três dimensões para explorar as relações espaço-temporais das proteínas envolvidas na resposta ao dano do DNA.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Resposta ao Dano no DNA
- Imagem em Células Vivas
Antecedentes
- Compreender a resposta ao dano no DNA é essencial para a regulação do ciclo celular.
- Os marcadores fluorescentes ajudam a visualizar a dinâmica de proteínas em células vivas.
- As técnicas de imagem 2D e 3D aprimoram a análise espacial e temporal.
- 53 BP1 é uma proteína-chave envolvida na resposta ao dano no DNA.
Objetivo do Estudo
- Visualizar a ativação e a localização de proteínas de sinalização de danos no DNA.
- Analisar os efeitos de agentes que danificam o DNA sobre a dinâmica celular.
- Estudar o comportamento de proteínas durante a mitose.
Métodos Utilizados
- Transfectar ou transduzir linhagens celulares com construtos marcadores fluorescentes.
- Adquirir vídeos controle de células marcadas fluorescentemente em condições normais.
- Aplicar tratamentos e capturar dados sobre os efeitos dos tratamentos.
- Analisar os dados de vídeo para identificar relações espaciais e temporais das proteínas.
Resultados Principais
- A microscopia de fluorescência de células vivas revela a dinâmica da formação de focos de 53 BP1.
- O comportamento das proteínas durante a mitose é influenciado por agentes que danificam o DNA.
- A imagem em 2D e 3D fornece informações sobre as respostas celulares aos tratamentos.
- As relações espaciais e temporais entre proteínas podem ser efetivamente analisadas.
Conclusões
- Este método permite a observação detalhada de proteínas da resposta ao dano no DNA.
- A microscopia de células vivas é uma ferramenta poderosa para o estudo da dinâmica celular.
- Compreender esses processos pode orientar estratégias terapêuticas contra danos no DNA.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem 2D e 3D de células vivas de proteínas da resposta ao dano no DNA, como a 53BP1, permite a visualização direta da dinâmica espaciotemporal das proteínas após estresse genotóxico. Essa capacidade apoia a desmistificação mecanicista e a confiança preditiva no estágio inicial de descoberta, especialmente para alvos e vias envolvidos na estabilidade genômica. A integração dessas abordagens de imagem orienta as decisões de validação de alvos e triagem de portfólio em programas de oncologia e manutenção do genoma.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação em tempo real da ativação da via de reparo do DNA e do recrutamento de proteínas.
- Apóia a validação funcional de alvos da DDR mediante a visualização da localização e cinética das proteínas.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao esclarecer o envolvimento da via e o contexto celular.
- Oferece confiança preditiva para o avanço de moduladores da DDR ou estratégias de letalidade sintética.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Estabelece sistemas validados de células vivas para avaliação quantitativa da dinâmica de proteínas da DDR.
- Permite medição reprodutível da formação de focos e alterações na cromatina após tratamento.
- Apoia a padronização de ensaios para triagem de compostos que visam vias de reparo do DNA.
- Permite adaptação escalonável a múltiplas linhagens celulares e fundos genéticos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha os resultados de imagem com modelos relevantes para a doença de instabilidade genômica.
- Oferece continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica de agentes direcionados à DDR.
- Permite avanço ajustado ao risco ao vincular leituras mecanicistas a pontos finais translacionais.
- Apoia o desenvolvimento de biomarcadores para o engajamento da via DDR.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de imagem atua na interface entre a fase inicial de descoberta e a identificação de compostos promissores, apoiando tanto a validação de alvos orientada por hipóteses quanto o desenvolvimento de ensaios subsequentes para programas focados na resposta a danos no DNA (DDR).
- Biologia da Descoberta: Visualiza o recrutamento de proteínas e a remodelação da cromatina em resposta a danos no DNA, esclarecendo a função da via.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis de focos de proteínas da DDR para avaliação de compostos.
- Análises: Permite a medição da dinâmica espaciotemporal de proteínas e a comparação entre tratamentos ou linhagens celulares.
- Pesquisa Translacional: Conecta resultados de imagem mecanicistas a modelos relevantes para doenças e estratégias de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável para o estudo de diversas proteínas e vias da DDR em múltiplos projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos da DDR.
- Valor Operacional: Padroniza fluxos de trabalho de microscopia de células vivas para garantir reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avançar/não avançar e a alocação de recursos ao fornecer dados mecanicistas robustos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de ativos direcionados à DDR e estratégias de biomarcadores translacionais.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em imagem de células vivas, engenharia de proteínas fluorescentes e análise de imagens.
- Exige acesso a microscopia confocal avançada e sistemas de controle ambiental.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de imagem e das linhas de análise de dados.
- Adaptável a diversas linhagens celulares e proteínas da DDR com o design apropriado de construtos.
- As condições de imagem devem ser otimizadas para minimizar o fotodesvanecimento e garantir a qualidade dos dados.
