Exame de seleção positiva e negativa Tímico por citometria de fluxo

O objetivo geral do experimento a seguir é examinar o desenvolvimento timocítico em camundongos por citometria de fluxo. Isso é realizado preparando suspensões de células únicas a partir do timo e do baço do camundongo. Como segundo passo, os timócitos e as células são corados com um coquetel de anticorpos para a identificação de populações timocíticas específicas.

No final, a frequência e o número de várias populações de linfócitos podem ser avaliados por meio de análise citométrica de fluxo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no desenvolvimento de linfócitos T, como quais genes e vias são importantes para gerar um repertório de células T funcional, porém tolerante a células. Embora este método possa fornecer informações sobre o desenvolvimento de células T no timo, ele também pode ser aplicado no exame do desenvolvimento de outros tipos de células imunes.

Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldade no planejamento de seus coquetéis de anticorpos para citometria de fluxo. Antes de iniciar a dissecação, coloque uma tela de malha de aço estéril em uma placa de Petri de 60 por 15 milímetros. Em seguida, adicione cinco mililitros de HBSS à placa e armazene-a em gelo para a coleta do timo.

Primeiro, use um par de pinças para levantar a ponta inferior do esterno e revelar o diafragma. Em seguida, evitando o fígado, corte o diafragma para soltar a caixa torácica e depois corte a caixa torácica em direção ascendente em cada lado. Tendo cuidado para não atingir os pulmões e o coração.

Agora, use a pinça para puxar suavemente a caixa torácica para trás. O timo é um órgão branco bilobulado localizado acima do coração. Use a borda plana da pinça para segurar a parte inferior dos lobos.

Em seguida, puxe suavemente o timo para fora e coloque-o em uma das telas de malha previamente preparadas. Para coletar o baço, faça uma incisão através do peritônio para expor a cavidade abdominal. O baço é um órgão vermelho com formato semelhante ao de uma prancha de surfe, localizado no lado esquerdo da cavidade abdominal do camundongo, abaixo do fígado.

Em seguida, use um par de pinças para remover o baço e outro par para separar cuidadosamente o tecido conjuntivo. Então, coloque o baço dissecado em uma tela de malha separada. Agora, use o êmbolo de uma seringa de três mililitros para macerar cada órgão contra a sua tela de malha até que apenas o tecido conjuntivo e a gordura permaneçam. Pipete as células e o HBSS para um tubo cônico de 15 mililitros.

Em seguida, lave cada malha com HBS S3 fresco três vezes. Depois, centrifugue as células por cinco minutos a 335 ×g e 4 °C. Após aspirar o sobrenadante, suspenda as células em 500 µL de um tampão de lise CK por 10 minutos à temperatura ambiente, enquanto as hemácias esplênicas estão sendo lisadas.

Suspenda os timócitos a 20 vezes 10 à sexta células por mililitro em tampão fax e reserve em gelo. Agora, adicione cinco mililitros de HBSS para restabelecer a isotonicidade após centrifugar as células novamente; ressuspenda o pellet livre de hemácias a 20 vezes 10 à sexta células por mililitro em tampão fax. Inicie este passo por Ali Watting.

Quatro vezes 10 elevado à sexta dos TIMOCITOS reservados por amostra de citometria de fluxo em cada poço de uma placa de 96 poços. Em seguida, adicione células aos poços de uma placa de 96 poços para controles de compensação. Em seguida, bloqueie os receptores FC em cada uma das amostras celulares por meio de incubação com anti-CD16/32 durante 10 minutos no gelo.

Agora, centrifugue a placa e, em seguida, remova o líquido dos poços virando a placa uma vez com a face para baixo sobre a pia; depois, re-suspenda cada poço em 200 microlitros de tampão fax e repita a lavagem. Em seguida, incube as amostras experimentais com 200 microlitros de coquetel de anticorpos ou anticorpos conjugados com um único fluoróforo para os controles de compensação. Tudo em tampão fax, sobre gelo e no escuro.

Após 30 minutos, lave as células duas vezes com tampão fax e, em seguida, após ressuspender as células em tampão fax, transfira as amostras para tubos fax em modelos transgênicos fisiológicos de TCR e camundongos selvagens. A seleção positiva começa na fase duplo-positiva brilhante antes de avançar para a fase duplo-positiva opaca. Após o encontro com o antígeno, os timócitos duplo-positivos opacos entram então em uma fase transitória CD4 positivo CD8 baixo antes de se tornarem CD4.

Timócitos únicos positivos para CD8 ou timócitos únicos positivos CD8 são caracterizados por sua alta expressão de TCR e perda de CD24. Embora o perfil CD8 por CD4 possa revelar defeitos na seleção positiva, examinar TCR beta por CD69 ou CD5 pode fornecer mais informações sobre onde o defeito se localiza. Tanto o CD69 quanto o CD5 são regulados positivamente após a estimulação do TCR, sendo interações mais fortes responsáveis por induzir maior expressão desses marcadores.

Neste gráfico de TCR beta por CD69 em um camundongo selvagem, o agrupamento TCR beta baixo CD69 negativo representa uma população de timócitos duplo-positivos pré-seleção. Já o agrupamento TCR beta intermediário CD69 positivo representa uma população transitória logo após o engajamento do TCR e consiste em duplo-positivos intensos, com alguns duplo-positivos fracos e células CD4 positivas CD8 baixas. Aqui, o agrupamento TCR beta alto CD69 positivo ilustra a população de células logo após a seleção positiva, que consiste em duplo-positivos fracos, CD4 positivas, CD8 baixas e células CD4 simples-positivas.

Por fim, esse perfil de células TCR beta alto CD69 negativo mostra uma população mais madura de células que consiste principalmente em células duplo-positivas para CD4 e CD8. A ausência das populações intermediárias de TCR beta R CD69 positivo e TCR beta alto R CD69 positivo pode indicar alterações no processo de seleção positiva, bem como mudanças na proporção entre células CD4 simples positivas e CD8. Alterações na proporção de células simples positivas para CD4 e simples positivas para CD8 dentro da população TCR beta alto CD69 negativo podem sugerir comprometimento no compromisso de linhagem.

A perda das populações TCR beta alta CD 69 positiva e TCR beta alta CD 69 negativa pode refletir problemas de sobrevivência após a seleção positiva. Analisar TCR beta por meio do CD cinco é outra estratégia para identificar populações pré e pós-seleção positiva. Essas duas primeiras populações consistem principalmente em timócitos duplo-positivos intensos.

A população com baixa expressão de TCR beta e baixa expressão de CD cinco representa timócitos duplo-positivos pré-seleção, e a população com expressão intermediária de TCR beta e intermediária de CD cinco é composta pelas células que iniciam a seleção positiva. A geração prejudicada dessa ou da população anterior sugere uma seleção positiva defeituosa. A população com expressão intermediária de TCR beta e alta expressão de CD cinco, no entanto, representa timócitos em processo de seleção positiva e consiste principalmente em duplo-positivos atenuados e positivos para CD quatro.

Linfócitos T CD8 de timócitos. A população TCR beta alta CD5 alta consiste principalmente de timócitos pós-seleção positiva. Mudanças na proporção de CD4, timócitos positivos simples para CD8.

Células duplamente positivas dentro dessa população, apesar de populações anteriores normais, podem sugerir alterações no comprometimento da linhagem. Além disso, a ausência dessa população pode indicar uma sobrevida reduzida de timócitos após a seleção positiva, já que a seleção negativa envolve a eliminação de pequenas populações específicas para antígenos. Defeitos nesse processo são melhor observados utilizando camundongos transgênicos para TCR; em timócitos de camundongos CD4 HY, os timócitos que expressam o TCR-H-Y transgênico podem ser detectados com o anticorpo monoclonal T3.7.

O H-Y-T-C-R reconhece o antígeno específico do macho HY apresentado dentro do MHC Classe I db. Assim, camundongos CD4 HY machos sofrem seleção negativa de timócitos positivos para H-Y-T-C-R, conforme indicado pela redução nos números de timócitos duplo-positivos positivos para T3.70 e por uma diminuição mais acentuada nos números de timócitos CD8 simples-positivos positivos para T3.7. Em contraste, camundongos CD4 HY fêmeas sofrem seleção positiva para gerar linfócitos T CD8 simples-positivos positivos para T3.7.

Embora a redução no número de timócitos duplo-positivos seja indicativa de seleção negativa, a ausência de timócitos simples-positivos específicos ao antígeno é a medida mais precisa. A análise adicional dos poucos timócitos simples-positivos T3.70 positivos CD8 em camundongos HYCD4 machos revela que a maioria são células imaturas CD24 alta. Enquanto isso, a maioria dos timócitos simples-positivos T3.70 positivos CD8 nos camundongos HYCD4 fêmeas já atingiu a maturidade e são CD24 baixa, fornecendo apoio adicional ao fato de que a seleção negativa ocorre em camundongos HYCD4 machos.

Uma limitação dos modelos transgênicos de TCR é que é difícil caracterizar ainda mais a seleção positiva identificando populações com base na expressão de TCR e CD69 ou CD5, devido à alta expressão de TCR durante todo o desenvolvimento de timócitos. Em camundongos HY CD4 fêmeas, há uma grande população de timócitos duplo-positivos positivos para T3.70 que passam pela seleção positiva, como indicado pelo aumento da população positiva para CD69 em comparação ao tipo selvagem. A seleção negativa envolve um estímulo de TCR de maior afinidade do que a seleção positiva, o que é indicado pela expressão mais elevada de CD69 em timócitos duplo-positivos positivos para T3.70 em camundongos HY CD4 machos, resultando em um deslocamento do pico do histograma para a direita.

Tendências semelhantes são observadas com a expressão de CD cinco ao analisar a seleção tímica em camundongos geneticamente manipulados. A análise da expressão de CD 69 ou CD cinco pode determinar se o defeito está relacionado à sinalização do TCR ou a um resultado downstream da estimulação do TCR. Após dominada, esta técnica pode ser realizada em duas horas e meia para preparação e coloração celular, mais uma hora adicional para coleta de dados no citômetro de fluxo.

Se realizado corretamente, cada camundongo adicional acrescentará aproximadamente 30 minutos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manipular os timócitos com cuidado e garantir que você já tenha planejado a estratégia de marcação previamente. Após seguir este procedimento.

Outros ensaios, como ensaios de eliminação ou ensaios de produção de citocinas, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como se os timócitos exportados funcionam adequadamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como analisar o desenvolvimento do timo utilizando citometria de fluxo.