Eletroencefalografia simultânea, em tempo real de medição da concentração de lactato e Manipulação optogenética da atividade neuronal do córtex cerebral de roedores

O objetivo geral deste procedimento é medir o sono definido por EEG e a concentração de lactato durante a estimulação optogenética em coordenadas estereotáxicas precisas. Implante cirurgicamente os eletrodos eletrencefalográficos necessários e cânulas para um sensor de lactato e um cabo de fibra óptica. Em seguida, insira o cabo de fibra óptica e o sensor de lactato previamente calibrado em suas cânulas-guia no crânio do animal.

Em seguida, ajuste a intensidade do estímulo de luz azul para obter a resposta eletrofisiológica desejada. Então, prossiga com a coleta de dados eletroencefalográficos, eletromiográficos e de concentração de lactato enquanto o animal é deixado livre para se comportar espontaneamente ou dormir. Em comparação com outros métodos, como estudos farmacológicos do EEG, esta abordagem experimental apresenta a vantagem de monitorar a bioquímica e a eletrofisiologia cerebrais enquanto a atividade dos neurônios é manipulada em tempo real em uma escala de tempo inferior ao segundo.

Portanto, o potencial para gerar novas descobertas no campo da pesquisa do sono é elevado. Por exemplo, é possível identificar os correlatos metabólicos e eletrofisiológicos do sono de ondas lentas. Esse tipo de experimento também pode ser aplicado em outras áreas da neurociência, como aprendizado e memória, plasticidade sináptica ou distúrbios epilépticos.

A técnica cirúrgica é tecnicamente desafiadora. Exige um bom nível de destreza, mas isso pode ser alcançado com a prática. Nesta demonstração visual, apresentarei os passos críticos de alguns procedimentos cirúrgicos complexos que complementam a descrição escrita.

Uma vez que o animal tenha se recuperado da cirurgia, o desafio é inserir corretamente o sensor de lactato e o cabo de fibra óptica. Jonathan e eu demonstraremos como usar uma mão firme ao imobilizar o animal para inserir esses dois equipamentos delicados. Por fim, mostraremos como otimizar a resposta do EEG ajustando em tempo real a intensidade do estímulo.

Para este experimento, utilize camundongos transgênicos que expressam o canal catiônico sensível à luz azul. O canal é expresso em dois tipos de neurônios da córtex cerebral. Primeiro, anestesie o camundongo usando 5% de isoflurano, 95% de oxigênio para indução, mantendo a anestesia com 3% de isoflurano, 97% de oxigênio.

Realize uma incisão medial no topo do crânio, da região entre os olhos até a parte posterior do crânio. Limpe o crânio com peróxido de hidrogênio e solução salina estéril. Localize e marque os pontos B e Lambda para determinar as coordenadas estereotáxicas para as configurações de estímulo optogenético do eletrodo; pré-fure os orifícios para os parafusos com uma broca dentária de alta velocidade utilizando uma ponteira esférica de 0,5 milímetro, seguida por uma ponteira esférica de 0,7 milímetro.

Insira os parafusos de eletrodo de kelo grama nos orifícios com uma chave de fenda com ranhura. Parafuse-os aproximadamente quatro a cinco voltas para obter a profundidade desejada. Mantenha as cânulas-guia no lugar com uma cânula estereotáxica e, em seguida, fixe-as ao crânio e aos suportes com cimento acrílico. Para manter a patência, cada cânula-guia deve conter uma cânula falsa ou estiloide desde o momento da cirurgia até o momento do experimento.

Uma vez posicionados os eletroencefalogramas e as cânulas-guia no crânio, una-os com uma fina camada de cimento acrílico dental. Após o endurecimento do cimento, posicione o conector plástico acima do montículo de cimento seco, conectando as extremidades dos fios provenientes dos eletrodos de EEG aos contatos no conector plástico, no caso de os fios estarem embutidos no cimento. Em seguida, passe os fios do eletromiograma através dos músculos nucleares deslizando-os dentro do corpo de uma agulha de calibre 21.

Perfure o músculo e dê um nó cirúrgico duplo com sutura de náilon 5-0 ao redor desses fios, logo distal ao ponto em que eles saem do músculo. Suture novamente a pele que foi retraída para acessar o tecido muscular com pontos cirúrgicos interrompidos simples, utilizando uma agulha reversa cortante P-3 e sutura de náilon 5-0. Uma vez programada a unidade de estímulo mc, execute-a como um gerador de sinal independente, produzindo um sinal binário liga-desliga de cinco volts. Conecte a unidade de estímulo mc à unidade de potência habilitada para TTL do laser usando conectores BNC.

Conecte a unidade de alimentação do laser ao laser por meio de um cabo de fita. Conecte também o laser ao conector FC macho no cabo de conexão óptica de origem. Conecte o cabo de fibra óptica de origem à junta rotativa.

A junta rotativa de fibra óptica atua como um comutador. À medida que o animal se movimenta pela sua gaiola, a junta rotativa gira para evitar a ruptura dos cabos de fibra óptica devido ao torque rotacional. Com abraçadeiras plásticas, fixe o comutador a um suporte metálico colocado acima da gaiola cilíndrica onde o animal é mantido.

Restrinja o camundongo utilizando uma das mãos para segurá-lo sob uma palma curvada. Oriente a cabeça entre o dedo médio e o indicador do pesquisador. Agora, limpe a cânula guia de detritos, utilizando uma agulha estéril de 25 mm de diâmetro.

Em seguida, insira o cabo de fibra óptica manualmente e fixe-o à cânula guia de fibra óptica com uma tampa rosqueável. Controle a profundidade de inserção do cabo de fibra óptica no cérebro por meio de um nó de sutura amarrado no cabo de fibra óptica a uma distância fixa da extremidade plana clivada. O sensor é equilibrado em solução salina tamponada com fosfato e exposto a três concentrações de L-lactato de maneira sequencial.

De acordo com os protocolos do fabricante, insira o sensor pré-calibrado na cânula guia para lactato fixada no crânio, de maneira idêntica ao procedimento de inserção do cabo de fibra óptica. Conecte o sensor de lactato ao pré-amplificador do biossensor Pinnacle 8,400 utilizando conectores bipolares. Em seguida, fixe este pré-amplificador ao conector de oito pinos no suporte craniano implantado cirurgicamente.

Antes de coletar os dados, use o botão de controle de intensidade do laser para ajustar a intensidade do estímulo optogenético. A amplitude da resposta de EEG variará entre os animais devido a fatores que não foram estudados de forma sistemática. É, portanto, necessário ajustar a intensidade do estímulo optogenético e verificar se a resposta de EEG é adequada quando a resposta desejada for alcançada.

Colete os dados utilizando o sistema Pinnacle 8, 400 com o neuro score. Uma interface SEIA classifica os estados de sono por inspeção visual dos dados de EEG e EMG processados. Os dados são registrados em épocas de dez segundos como vigília, sono não REM (movimento rápido dos olhos) ou sono REM, com base no EEG e no EMG.

Esta configuração de estímulo optogenético do biossensor mostra os eletrodos de EEG implantados cirurgicamente, o sensor de lactato e a cânula para estimulação optogenética. Na ausência de estimulação optogenética, este camundongo apresentou sono espontâneo. As transições entre estados de vigília enquanto o EEG-EMG e a concentração cerebral de lactato foram monitorados continuamente durante a vigília e os dois subtipos de sono.

O movimento rápido dos olhos e o movimento não rápido dos olhos são definidos com base no EEG e no EMG. Curiosamente, a corrente do biossensor de lactato aumenta em função do EEG de baixa amplitude e diminui em função do EEG de alta amplitude. Ambos os canais do EEG respondem a estímulos optogenéticos aplicados na córtex frontal.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como implantar cirurgicamente um camundongo para manipulação optogenética simultânea e medição do eletroencefalograma, eletromiograma e concentração de lactato no cérebro. Uma vez dominada, essa técnica cirúrgica pode ser realizada adequadamente em 90 a 120 minutos. Lembre-se de monitorar constantemente a respiração do animal como indicador da profundidade da anestesia.

Se o animal respirar com menos frequência do que uma vez a cada quatro ou cinco segundos, a anestesia pode estar muito profunda. Se o animal respirar com mais frequência do que uma vez a cada dois segundos, a anestesia pode estar muito leve. Lembre-se de tomar as precauções de segurança apropriadas ao usar o agente anestésico gasoso isoflurano.

Garanta ventilação adequada na sala cirúrgica para proteger sua retina do laser utilizado para estimulação optogenética. Use óculos de proteção ou coloque o animal em um gabinete à prova de luz. Você precisará praticar a implantação do biossensor de lactato e do cabo de fibra óptica em um camundongo totalmente acordado.

Os camundongos não são colaborativos com esses procedimentos e devem ser imobilizados. No entanto, o contenção não pode ser tão intensa a ponto de ferir o animal ou impedir a respiração.