Antígeno Artificial célula apresentadora de ativação mediada (AAPC) e expansão de células T Natural Killer
29 de dezembro de 2012
Aqui nós descrevemos um método para ativar e expandir células humanas NKT de granel populações de células T com células artificiais apresentando antígeno (AAPC). O uso de CD1d baseado AAPC fornece um método padronizado para a geração de números elevados de células NKT funcionais.
O objetivo geral deste procedimento é gerar células apresentadoras de antígeno artificiais baseadas em CD1D ou AAPC para a expansão de células T NK. Isso é realizado primeiramente adicionando proteínas para funcionalizar as microesferas magnéticas. Na segunda etapa, a população inicial de células T NK do sangue periférico é enriquecida.
Em seguida, os linfócitos T enriquecidos são cultivados em co-cultura com as APCs. Na etapa final, o fenótipo e a função da população de células APCs são avaliados. Por fim, a pureza dos subconjuntos de linfócitos T expandidos pode ser determinada por análise citométrica de fluxo. A principal vantagem das APCs em relação aos métodos atuais que utilizam células dendríticas é que as células dendríticas podem apresentar alta variabilidade entre doadores.
As APCs fornecem um método padronizado, reprodutível e disponível comercialmente para a expansão de células T NK. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando eu trabalhava com o Dr. Schneck e Oaky na Johns Hopkins. Eles foram pioneiros no campo do uso de complexos artificiais de apresentação de antígenos para a expansão de subpopulações clássicas de células T CD8.
Quem demonstrará o procedimento será o Dr. James East, pesquisador pós-doutorando, e o filho da Dra. Wendy, um pesquisador colaborador do meu laboratório. Comece transferindo um mililitro de esferas Dyna Bead M-450 com revestimento epóxi para um frasco de vidro borossilicato transparente rosqueado de cinco mililitros. Em seguida, lave as esferas com três mililitros de tampão Bore 8 estéril em um tubo microcentrífuga separado de 1,5 mililitro.
Adicione 100 microgramas de dímero IG de CD1D humano e 20 microgramas das moléculas coestimuladoras desejadas a um mililitro de PBS livre de cálcio e magnésio. Em seguida, coloque o frasco de vidro com as esferas sobre um ímã e aspire o tampão borato. Então, adicione a mistura proteica ao frasco de vidro e recoloque a tampa.
Imediatamente misture a solução invertendo o frasco, depois cubra a tampa com parafina e coloque-o em um rotador durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte. Coloque o frasco de vidro no ímã novamente e remova cuidadosamente a mistura proteica, evitando as microesferas. Lave as microesferas três vezes, adicionando três mililitros de tampão de lavagem das microesferas e incubando-as no rotador a quatro graus Celsius por cinco minutos.
Para confirmar que as proteínas estão estavelmente ligadas às microesferas, marque uma alíquota das microesferas com anticorpos e analise-as por citometria de fluxo. Agora, transfira cinco vezes 10 elevado à sétima microesferas para um pequeno vial de vidro de 1,5 mililitro e lave as microesferas com um mililitro de PBS estéril. Em seguida, 48 a 72 horas antes do uso.
Carregue as esferas lavadas com antígeno em um mililitro de PBS estéril enquanto as esferas estão sendo carregadas com o antígeno. Colete os PBMC primeiro diluindo o sangue do doador heparinizado com um volume igual de PBS à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 15 mililitros de PHI à temperatura ambiente, transfira para tubos cônicos de 50 mililitros e sobreponha lentamente 25 mililitros da mistura sanguínea diluída sobre o PHI.
Chame então após centrifugar as amostras por 30 minutos a 700 vezes G e temperatura ambiente com a frenagem desligada. Use uma pipeta Pasteur para transferir cuidadosamente a interface de linfócitos para um novo tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, lave os linfócitos com 50 mililitros de PBS, descartando o sobrenadante e combinando os tubos de um único doador em um único tubo.
Após lavar os PBMC novamente com 20 mililitros de PBS, conte as células e, em seguida, re-suspenda-as numa concentração de cinco vezes 10 à sétima células por mililitro em tampão max. Para isolar a fração de linfócitos T, incube 100 microlitros da solução de enriquecimento de linfócitos T PAN do kit de enriquecimento de linfócitos T humanos EP com dois mililitros de PBMC durante 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, incube a solução com 100 microlitros de microesferas magnéticas à temperatura ambiente por mais 10 minutos.
Complete o volume final do solvente até 2,5 mililitros e, em seguida, coloque o tubo no ímã. Após cinco minutos, despeje rapidamente a fração positiva de CD3 em um tubo cônico de 15 mililitros. Agora, lave as células com cinco mililitros de tampão Max frio e conte as células viáveis.
Retire uma alíquota para coloração de fatores a fim de selecionar primeiro as células positivas para CD161. Reuspenda os linfócitos T enriquecidos em 980 microlitros de tampão máximos gelado e, em seguida, incube as células com 10 microgramas de anticorpo monoclonal anti-CD161 por 10 minutos a quatro graus Celsius. Após lavar as células, reconstitua o pellet em 800 microlitros de tampão máximos e 200 microlitros de microesferas de anti-IgG de rato.
Incube esta solução a quatro graus Celsius por mais 10 minutos. Enquanto as células estão em incubação com os microesferas, adicione três mililitros de tampão max para equilibrar uma coluna LS. Após lavar esta fração celular, pipete lentamente as células em três mililitros de tampão max para dentro da coluna.
Agora, lave a coluna três vezes com três mililitros de tampão max fresco. Em seguida, adicione mais três mililitros de tampão max fresco à coluna e transfira a coluna para um tubo cônico de 15 mililitros. Empurre para fora as células CD161 positivas e CD3 positivas purificadas e, depois, conte a fração enriquecida em células NKT.
Inicie este passo com o co-cultivo de 10 elevado à sexta potência de células T CD161 positivas e CD3 positivas enriquecidas e 10 elevado à sexta potência de APC em 16 mililitros de meio completo em placa. Adicione 160 microlitros por poço do co-cultivo a uma placa de poliestireno tratada para cultura de tecidos, com fundo em formato U e tampa de baixa evaporação, em poços de 96. Entre os dias 12 e 14, recolha e conte as células. Analise as populações por citometria de fluxo, depois replante e co-cultive novamente.
As células T NKT expandidas, conforme acabou de ser demonstrado, congelam as células T NKT extras após a segunda rodada de expansão. Para testar a funcionalidade das células APC, realize primeiramente um co-cultivo de cinco vezes 10 à quarta potência de células T NKT por poço com cinco vezes 10 à quinta potência de APC em um volume final de 200 microlitros de meio completo em uma placa de fundo redondo com 96 poços. Após 24 a 48 horas, colete o sobrenadante da cultura celular para análise por ELISA. Esta primeira figura demonstra que as proteínas CD1D-Ig estão estavelmente imobilizadas na superfície das microesferas magnéticas, conforme mostrado aqui.
Os anticorpos CD1D IG e anti-CD28 são ambos expressos na superfície das microesferas magnéticas, conforme demonstrado neste gráfico. O hibridoma de células T NK de camundongo positivo para V alfa 14, DN30.2D3, foi co-cultivado com meio contendo antígeno alfa-galactosilceramida solúvel não carregado em APC ou com APC carregada com alfa-gal. Os sobrenadantes das culturas foram então coletados e a produção de IL-2 foi medida por ELISA, fornecendo um método simples para testar cada lote de células apresentadoras de antígeno. Neste experimento, células T periféricas do sangue humano positivas para CD161 e positivas para CD3 foram enriquecidas por separação com microesferas magnéticas.
As células foram então estimuladas uma vez por semana durante 14 dias com A APC carregado com alfa galera e analisadas quanto à expressão de V alfa 24 e V beta 11. Importante ressaltar que, mesmo com uma população inicial relativamente baixa de células NKT de 0,03%, foi possível expandir as células para cerca de 67% da população positiva para V alfa 24 e positiva para V beta 11. Aqui, células CCR CD1D foram incubadas com células NKT nas proporções indicadas na presença ou ausência do antígeno alfa Gal SER em placas de 96 poços com fundo em U durante 20 a 24 horas.
A lise celular mediada por células NKT da linhagem de linfoma de células B foi então avaliada por meio de ensaio de liberação de cromo. Células NKT expandidas em PC foram capazes de lisar esta linhagem de células linfomatosas. Na presença ou ausência de alfa-galactosilceramida, células NKT foram expandidas a partir de PBMC de voluntários saudáveis e de pacientes com câncer, e carregadas com alfa-galactosilceramida.
Uma PC foi capaz de expandir as populações de células NKT de ambos os grupos. Ao utilizar uma população inicial de 2 milhões de células T CD161 positivas e CD3 positivas, pode-se obter mais de 10⁷ células após duas rodadas de expansão. As células NKT expandidas podem ser usadas em estudos funcionais, como demonstrado aqui.
As células NKT expandidas ex vivo permanecem responsivas à estimulação com Alpha GAL e nossos potentes produtores de IL-17A, TNF-alfa e interferon-gama. Deve-se observar que, se a população inicial de enriquecimento de linfócitos T for baixa e o segundo passo de enriquecimento com CD161 não puder ser realizado, a expansão mediada por A APC pode não produzir os resultados esperados. No entanto, se a porcentagem de células NKT circulantes for superior a 0,1%, uma expansão significativa de células NKT invariantes ainda deverá ser possível de ser obtida.
Coletivamente, esses dados demonstram que o A A PC baseado em CD1D pode ser usado para expandir e estimular efetivamente linfócitos T NK humanos primários seguindo este procedimento. Outros métodos, como a PCR em tempo real, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como quais são a cinética da ativação dos linfócitos T NK após seu desenvolvimento. Esta técnica abre caminho para pesquisadores na área de hepatologia explorarem o papel das células T NK na doença hepática gordurosa.
Visão Geral
Este artigo descreve um método para ativar e expandir células NKT humanas a partir de populações bulk de células T utilizando células apresentadoras de antígeno artificiais (aAPC). O uso padronizado de aAPC baseadas em CD1d permite a geração de grandes quantidades de células NKT funcionais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Biologia Celular
- Medicina Translacional
Antecedentes
- As células NKT desempenham um papel crucial nas respostas imunes.
- Os métodos atuais que utilizam células dendríticas apresentam alta variabilidade entre doadores.
- As aAPCs oferecem uma abordagem reprodutível e padronizada.
- Trabalhos anteriores já estabeleceram o uso de complexos artificiais de apresentação de antígenos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para expandir células NKT a partir de sangue periférico.
- Utilizar aAPCs baseadas em CD1d para obter resultados consistentes.
- Avaliar a funcionalidade e pureza de subpopulações de células T expandidas.
Métodos Utilizados
- Funcionalização de microesferas magnéticas com proteínas.
- Enriquecimento de populações iniciais de células NKT a partir de sangue periférico.
- Co-cultivo de linfócitos T enriquecidos com aAPCs.
- Análise por citometria de fluxo para avaliar fenótipo e função celular.
Resultados Principais
- Números elevados de células NKT funcionais foram gerados com sucesso.
- O método demonstrou reprodutibilidade entre diferentes doadores.
- A análise por citometria de fluxo confirmou a pureza das células NKT expandidas.
- Ensaios funcionais indicaram a eficácia das aAPCs.
Conclusões
- As aAPCs baseadas em CD1d são uma ferramenta confiável para a expansão de células NKT.
- Este método pode aprimorar a pesquisa em imunoterapia.
- Estudos futuros podem explorar aplicações mais amplas das aAPCs.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Células apresentadoras de antígeno artificiais (aAPC) resolvem a variabilidade do doador na expansão de células NKT baseada em células dendríticas, permitindo a produção reprodutível de células NKT funcionais para pesquisas em imunoterapia. Este sistema padronizado apoia a validação de alvos e a modelagem pré-clínica, fornecendo uma plataforma escalonável e pronta para uso na geração de células NKT invariantes (iNKT) com fenótipo e função citotóxica consistentes. O método aumenta a confiabilidade preditiva na fase inicial de descoberta, reduzindo o ruído biológico associado à variabilidade das células apresentadoras de antígeno autólogas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação da apresentação de antígenos lipídicos por meio do CD1d para desvio mecanicista de respostas imunes mediadas por células NKT.
- Valor Operacional: Fornece um sistema reprodutível para o isolamento e expansão de células NKT invariantes a partir de sangue periférico, apoiando estudos consistentes de engajamento de alvo.
- Valor Científico: Facilita a validação funcional da citotoxicidade de células NKT contra linhagens tumorais, auxiliando na avaliação da confiança no alvo para candidatos a imunoterapia.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera células NKT expandidas adequadas para triagem de alto conteúdo de compostos imunomoduladores ou perfis de citocinas.
- Valor Operacional: Fornece preparações padronizadas de aAPC que garantem a reprodutibilidade do ensaio entre diferentes doadores e lotes experimentais.
- Valor Científico: Permite leituras quantitativas, como a secreção de IFN-γ, TNF-α e IL-17A, para o desenvolvimento de ensaios alinhados a biomarcadores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia a modelagem de sistemas relevantes para doenças ao expandir células NKT de doadores saudáveis e pacientes com câncer para testes funcionais pré-clínicos.
- Valor Operacional: Permite protocolos de expansão em duas etapas para obter números suficientes de células (>10⁷) para aplicações posteriores, como ensaios de liberação de cromo ou perfilagem de citocinas.
- Valor Científico: Mantém a funcionalidade das células NKT após a expansão, preservando a resposta à estimulação com α-GalCer e a capacidade de produção de citocinas para continuidade translacional.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método aAPC integra-se ao fluxo de trabalho de descoberta desde a validação inicial do alvo até a validação pré-clínica, permitindo a produção escalonável de células NKT para o avanço da linha de imunoterapia.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipóteses sobre interações entre antígenos lipídicos e CD1d e cinética de ativação de células NKT por meio de estimulação padronizada com aAPC.
- Triagem: Fornece células NKT prontas para ensaios, com fenótipos definidos Vα24⁺Vβ11⁺, para triagem de compostos e perfilagem de secreção de citocinas.
- Análises: Permite a quantificação por citometria de fluxo e por ELISA de marcadores de ativação e produção de citocinas para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta à validação pré-clínica ao gerar células NKT funcionais capazes de lisar tumores e secretar citocinas em contextos relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece o aAPC como uma tecnologia de plataforma reutilizável, reduzindo a dependência de células dendríticas derivadas de doadores, cuja variabilidade afeta diferentes projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na função de células NKT por meio da ativação e expansão padronizadas, reduzindo a ambiguidade mecanicista na validação de alvos em imunoterapia.
- Valor Operacional: Alta reprodutibilidade e escalabilidade mediante a produção pronta de aAPCs, minimizando a variabilidade entre lotes.
- Valor Estratégico: Melhora nas decisões de prosseguir/interromper o desenvolvimento de imunoterapias, reduzindo riscos biológicos tardios decorrentes de produtos celulares inconsistentes.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de terapias direcionadas a NKT com base em dados pré-clínicos de eficácia reprodutíveis.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em separação imunomagnética de células e citometria de fluxo para enriquecimento de células NKT e validação fenotípica.
- Depende do acesso a equipamentos para funcionalização de microesferas magnéticas, reagentes para conjugação proteica e infraestrutura estéril para cultivo celular.
- Necessita padronização dos protocolos de carregamento de aAPCs (por exemplo, α-GalCer e moléculas coestimulatórias) entre diferentes locais para desempenho consistente.
- As considerações para adaptação incluem a titulação das proporções entre aAPCs e células NKT, bem como as condições de carregamento antigênico, de acordo com as frequências iniciais de doadores distintos.
- Limitação prática: a eficiência de expansão pode ser reduzida se a frequência inicial de células NKT for inferior a 0,03% ou se o enriquecimento de CD161⁺CD3⁺ falhar, exigindo otimização da qualidade das células de entrada.
