Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

O objetivo geral deste procedimento é isolar, caracterizar e diferenciar células-tronco da polpa dentária humana de dentes permanentes utilizando dois métodos. Isso é realizado coletando dentes do siso impactados saudáveis e seccionando-os ao redor da junção cemento-esmalte no início. As células-tronco da polpa dentária (D PSCs) são isoladas por dois métodos diferentes.

No primeiro método, os tecidos de pólipo são digeridos enzimaticamente mediante incubação em colagenase tipo um mais solução do espaço discal. Aqui, chamamo-los de ed. Considerando o método de isolamento no segundo método, os tecidos de pálpebra são apenas colocados no frasco sem qualquer digestão.

Dessa forma, as dpss começam a migrar do tecido para o frasco. Essas células denominadas OG referem-se ao método de isolamento por crescimento periférico. O segundo passo do procedimento é a identificação de células-tronco utilizando citometria de fluxo.

O terceiro passo do procedimento é a indução da diferenciação de odontoblastos, e o passo final é a avaliação comparativa da diferenciação de odontoblastos entre dois grupos por meio da coloração em vermelho e QBCR. Sou RA Kde, do Departamento de Células-Tronco e Biologia do Desenvolvimento do Instituto Rian. Hoje vou mostrar a vocês o isolamento, a caracterização e a diferenciação comparativa de células-tronco mesenquimais humanas utilizando dois métodos.

Olá, sou o Dr. Rezaian do Instituto Rio. Estamos trabalhando em um projeto relacionado a células-tronco da polpa dentária humana. Essas células são um tipo de células-tronco mesenquimatosas, que são fáceis de obter com mínima dor e morbidade.

Células-tronco mesenquimais especificam-se pela capacidade plástica de formar colônias e por sua capacidade de diferenciação múltipla. Olá, sou a Dra. Ami do Departamento de Células-tronco. No instituto, utilizamos este procedimento em nosso laboratório para isolar células-tronco com finalidades de estudos de pesquisa e aplicações futuras.

Na medicina regenerativa, o primeiro passo para utilizar essa fonte de células-tronco em futuras terapias baseadas em células-tronco é escolher o melhor protocolo para o isolamento de células-tronco a partir de tecido pulpar humano. Para alcançar esse objetivo, é fundamental investigar certos aspectos do comportamento celular sob diferentes condições de isolamento de células-tronco. Primeiramente, vou isolar células-tronco da polpa dental humana utilizando dissociação enzimática da polpa ou o crescimento exógeno de células-tronco a partir de implantes teciduais.

Em seguida, caracterize e diferencie-os em blastocisto. Então, vamos começar. Primeiro, espaço e colagenase tipo um dissolvidos em PBS.

Em seguida, filtre-os usando um filtro de seringa de 0,2 mícrons. Transfira ambos para um tubo cônico. Em seguida, adicione pener e PBS para obter a concentração final.

Transfira dentes do siso saudáveis para o laboratório em meio básico frio, sob condição estéril. Limpe a superfície do dente com etanol 70% antes do estudo. Certifique-se de remover completamente qualquer resíduo da superfície do dente.

Corte o dente ao redor da junção cemento-esmalte utilizando um disco dentário esterilizado para expor a câmara pulpar. Deve-se considerar que o processo de corte deve ser realizado lentamente para reduzir o superaquecimento do tecido dentário. Em seguida, separe suavemente o tecido pulpar da coroa, ou seja, corte o tecido pulpar em pedaços de um a dois milímetros com a lâmina de Scarpa.

Transfira pequenos fragmentos de tecidos da polpa para um mililitro de solução enzimática durante uma hora a 37 graus Celsius, agitando em vórtex a cada 30 minutos para ajudar na dissociação dos tecidos da polpa. Em seguida, remova os agregados maiores passando-os por uma peneira celular de 70 mícrons. Depois, adicione PBS contendo PENER e centrifugue a 1.200 RPM por cinco minutos.

Remova o sobrenadante com cuidado. Em seguida, suspendemos a placa no meio de proliferação, transferimos para o frasco de cultura e adicionamos meio. Em seguida, incubamos.

Substitua o meio a cada três dias até que a confluência celular seja alcançada para o método de explante. Repita o processo de corte. Após o corte, fragmente os tecidos em pedaços de um a dois milímetros.

Em seguida, coloque-os na cultura. Incube com meio de proliferação e mantenha em incubação. Deve-se considerar que o volume total do meio de proliferação deve ser suficiente para suportar a adesão de todos os fragmentos para o posterior crescimento celular.

Troque o meio após observar o crescimento celular e, em seguida, a cada três dias até que seja alcançada a confluência celular. Para imunofenotipagem, incube ambos os tipos de DPSCs com anticorpos conjugados a PE ou FITC por 30 minutos a quatro graus Celsius no escuro. Em seguida, adicione PBS e centrifugue a 1.200 rpm por cinco minutos.

Remova o sobrenadante e ressuspenda, suspenda a placa em PBS e, finalmente, avalie os marcadores de superfície utilizando citômetro de fluxo em subcultura, ambos os tipos de DPCs por três passagens. Em seguida, trate com tripsina em gelo e transfira-os para seis placas de cultura vermelhas com 60% de confluência, substituindo o meio de manutenção (PM) pelo meio odontogênico. Três poços permanecem como controle negativo, adicionando PM.

Troque o meio a cada três dias. No 21º dia, lave as células com PBS. Em seguida, fixe-as com um mililitro por poço de gel de formal a 10% durante 15 minutos à temperatura ambiente.

Após 15 minutos, remova cuidadosamente o fixador e lave as células três vezes com água destilada. Em seguida, substitua a água por um mililitro por red alza em solução corante vermelha. Após 20 minutos, removemos o corante em excesso e lavamos as células quatro vezes com água deionizada.

Em seguida, adicione um mililitro de água por poço para evitar que as células sequem. Após a coloração, é possível observar três trilhos superiores ficarem vermelhos em comparação com os controles ao microscópio; com ampliação maior, é possível visualizar a absorção da coloração ao redor da célula para quantificação da coloração vermelha. Após a remoção da água, adicione um mililitro por poço de ácido acético a 10%, e incube por 30 minutos sob agitação.

Em seguida, desprenda suavemente as células da placa utilizando um espátula para células. Depois, transfira-as para tubos separados. VOR por 30 segundos vigorosamente.

Em seguida, aqueça-os a 85 graus Celsius por 10 minutos. Para evitar evaporação, feche os tubos com ParaView e transfira-os para gelo por cinco minutos; depois, centrifugue-os a 20.000 G por 15 minutos. Enquanto isso, prepare uma diluição seriada padrão de vermelho de Alzheimer de acordo com o protocolo da região.

Após a centrifugação, remova o sobrenadante e transfira para tubos novos. Neutralize o pH com hidróxido de amônio a 10%. Em seguida, adicione os padrões e as amostras também à placa de 96 poços.

Plaqueie bem a placa, então meça a absorbância em 405 nanômetros e analise os dados de acordo com a diluição seriada padrão. Aqui você pode observar DPCs, que são isoladas por dissociação enzimática no 10º, 15º e 18º dia, bem como DPCs expandidas nos 5º, 10º, 13º e 18º dias. Ambos os tipos de DPSCs no meio três estão praticamente com o mesmo tamanho e morfologia. Os resultados de imunofenotipagem mostram a presença de marcadores de células-tronco mesenquimais, como CD44, CD73 e CD19, e a ausência de marcadores hematopoiéticos e endoteliais, como CD34, CD45 e CD11B. Curiosamente, as expressões de CD105 e CD146 são maiores em DPSCs expandidas em comparação com as DPSCs isoladas por dissociação enzimática. A quantificação da coloração enzimática com vermelho de alizarina no 21º dia de diferenciação em odontoblastos mostra maior deposição de cálcio nas DPSCs isoladas por dissociação enzimática em comparação com as células-tronco dentárias sem indução.

Os resultados de QPCR também indicam expressões significativamente mais altas de MEP e A LP como marcadores de mineralização em D-P-S-C-D em comparação com as células-tronco dentárias em fase de saída. Enquanto isso, ambos os genes são regulados durante a diferenciação, e a expressão de DSPP, como marcador odontogênico, aumenta durante esse processo. No entanto, não há variação significativa na expressão de DSVP em células diferenciadas entre os grupos ED e OG.

Acabamos de mostrar como isolar células-tronco de partes dentárias humanas utilizando a dissociação enzimática da polpa ou o crescimento de células-tronco a partir de explantes teciduais. É isso aí. Desejamos boa sorte para tentar utilizar este procedimento em seu experimento.

Obrigado.