Citometria de massa: Protocolo para Ajuste Diário e amostras de células em execução em um citômetro de Massa CyTOF

O objetivo principal deste procedimento é demonstrar o ajuste diário adequado e a análise de amostras em um instrumento CyTOF. Primeiro, a máquina é montada e ligada. Em seguida, as configurações do instrumento são otimizadas para o ajuste com sinal máximo.

A máquina está então pronta para executar as amostras. Na etapa final, a máquina é limpa e desligada. Em última análise, dados celulares ideais podem ser obtidos de acordo com requisitos específicos de tempo.

A demonstração visual desta técnica é essencial. Os procedimentos diários de configuração, calibração e limpeza são difíceis de aprender a partir do manual, pois envolvem múltiplas etapas de software simultâneas.

Você precisa adquirir experiência para desenvolver uma percepção sobre os níveis de fundo e intensidades de sinal apropriados. Pelo menos 15 minutos antes de iniciar um experimento, abra o programa de software do CyTOF e selecione a configuração do instrumento. Em seguida, na guia do alojamento de placas, clique no botão ligar o aquecedor para permitir que a camisa da câmara de nebulização atinja 200 graus Celsius.

Substitua a seringa na bomba de seringa por uma seringa nova preenchida com água milli cube. Em seguida, limpe o nebulizador fazendo uma lavagem reversa com 5% de Citron duas vezes por cada porta. Para remover qualquer resíduo de Citron, repita a lavagem reversa com água Milli Q.

Em seguida, abra a válvula do tanque de gás argônio, fazendo com que a luz Argonne na frente da máquina se acenda. Depois, conecte o nebulizador à entrada de gás de compensação e ligue o nebulizador ao tubo de introdução de líquido. Insira a extremidade do nebulizador na abertura branca no manto de aquecimento na aba do controlador RFG da janela de configuração do instrumento.

Clique em iniciar plasma, depois clique em ok. Após a inicialização terminar, clique em ok novamente na janela pop-up. Agora ligue a bomba de seringa.

Ao reabastecer a seringa, pressione o botão de parada em vez do botão de pausa para redefinir o contador de volume. Antes de calibrar o citômetro de massa, certifique-se de que ele tenha aquecido por 20 minutos. Uma vez que a máquina tenha estabilizado, clique no botão de configurações de aquisição para abrir a janela de configurações de aquisição de dados. Na guia analitos.

Clique na tabela periódica para abrir o painel de seleção de isótopos. Em seguida, selecione os isótopos na solução de ajuste DVS Sciences listada no manual e clique em salvar. Depois, clique no botão isótopos por leitura para abrir a janela de massas por leitura.

Selecione a contagem de pulsos e reajuste o eixo y inserindo um novo número e pressionando enter. Agora, encha uma seringa verde de um mililitro norm inject com solução de calibração. Gire o seletor de porta da amostra para carregar.

Injete 450 microlitros de solução de calibração e, em seguida, gire o seletor para injetar. Aguarde até que os isótopos da solução de calibração comecem a aparecer como traços neste visor. Os sinais no tempo de voo, na região de 9.400 a 9.800, são devidos aos isótopos de xenônio no gás argônio.

Agora retorne à janela de massas por leitura e clique no botão verde de reprodução. Cada linha colorida representa isótopos selecionados da guia de analitos. Quando os níveis de isótopos estiverem estáveis, ajuste a corrente selecionada no menu suspenso na guia de parâmetros da janela de configurações de aquisição de dados.

Na janela inicial, insira zero para o término, insira 10. Para o valor do passo, insira 0,5 e, para o tempo de estabilização, insira 200. Em seguida, clique em salvar.

Em seguida, clique novamente na janela de massas por leitura e clique em reproduzir. Após observar onde os sinais dos isótopos atingem o pico, vá até a guia de configuração do canal DAC na janela de configuração do instrumento. Role para baixo até a corrente e insira o valor do pico do isótopo.

Clique em definir valor atual da corrente e, em seguida, salve. Em seguida, altere o menu suspenso para gás de composição. Insira 0,55 na janela de início, 0,95 na janela final, 0,05 na janela de valor do passo e 200 na janela de tempo de estabilização.

Clique em salvar. Após retornar à janela de massas por leitura e clicar em reproduzir novamente, o eixo x exibirá agora a taxa de fluxo do gás de arraste. Observe os valores onde os sinais dos isótopos atingem o pico e note o aumento rápido do sinal GD 1 55 próximo ao final.

Em seguida, retorne à guia de configuração do canal DAC. Role para baixo até a seção de correção, gás, e insira o novo valor do pico de isótopo. Clique em definir valor atual.

Em seguida, clique em salvar novamente para registrar a razão entre o isótopo desejado e o óxido. Primeiro, faça uma segunda injeção de 450 microlitros da solução de calibração. Depois, na guia de parâmetros, selecione tempo no menu suspenso e insira zero na janela de início, 10 na janela de fim, um na janela de valor do passo e 200 na janela de estabilização.

Após clicar em reproduzir na janela de massas por leitura, use o cursor para ler o valor mais alto para TM 1 69 ou TB 1 59, e também o valor GD 1 55. Agora, injete três mililitros de água Milli Q através do loop de amostra, seguidos por 500 microlitros de solução de lavagem DVS. Na guia de calibração de massa, clique em executar para monitorar o progresso da lavagem de limpeza até que a intensidade das faixas comece a diminuir.

Em seguida, adicione três mililitros de água millicubo e monitore até que as faixas diminuam até os níveis de fundo. Comece inserindo os isótopos da amostra conforme demonstrado anteriormente para os isótopos da solução de calibração e, depois, clique em salvar. A seguir, abra a janela de aquisição e altere as configurações de aquisição conforme necessário para o volume da amostra.

Por exemplo, uma amostra de 450 microlitros preencherá o loop de amostragem e levará 600 segundos para ser executada, permitindo acomodar atrasos na aquisição dos dados celulares. Defina o atraso de aquisição em pelo menos 30 segundos e o atraso de estabilidade do detector em pelo menos 20 segundos antes da execução. Lave as amostras celulares pelo menos duas vezes com água milli cube e, em seguida, re-suspenda a amostra em uma concentração máxima de 10 elevado a seis células por mililitro e filtre a solução celular resultante através de um filtro celular de 35 micrômetros.

Para remover quaisquer agregados. Agora, insira um novo nome de arquivo para a amostra atual. Observe que todos os arquivos devem ser salvos na unidade E.

Em seguida, mude a válvula do loop da amostra para carregar, injete a amostra, retorne a válvula do loop da amostra para injetar e clique em executar na janela de aquisição. As células serão representadas na janela de instantâneo como conjuntos horizontais de marcas em cada canal isotópico vertical e exibirão a melhor resolução em torno de 300 a 500 células por segundo, conforme demonstrado aqui.

Quando a aquisição de dados da amostra for concluída, uma janela pop-up aparecerá. Clique em OK para confirmar a conclusão da análise da amostra e, em seguida, injete pelo menos 500 microlitros de água MQ entre cada amostra para ajudar a minimizar qualquer contaminação cruzada e limpar o equipamento. Após o uso, injete 450 microlitros de solução de lavagem no loop de amostra. Monitore a liberação de metal livre e, em seguida, enxágue o loop de amostra com três mililitros de água Milli Q, monitorando o lavado até que sejam alcançados níveis de fundo de arraste.

Em seguida, para desligar o equipamento, selecione a guia do controlador RFG na janela de configuração do instrumento e clique em parar plasma. Quando o procedimento estiver concluído, clique em ok na janela pop-up, que recomenda a remoção do nebulizador na guia sob o compartimento de cartões. Desligue o aquecedor, feche a válvula da fonte de argônio e, em seguida, puxe cuidadosamente para trás o nebulizador para removê-lo da câmara de pulverização.

Em seguida, desparafuse o tubo de introdução da amostra e coloque-o de lado. Desparafuse a conexão de introdução do gás de compensação até que afrouxe ligeiramente e, então, retire o nebulizador. Por fim, utilizando a mesma seringa e tubo conforme demonstrado anteriormente, limpe ambas as portas do nebulizador com Citron 5% e guarde o nebulizador coberto com Citron 5% até o próximo uso.

A lavagem adequada do citômetro de massa com água UE e solução de lavagem DVS reduzirá os níveis de absorção de metais nos tubos e em outras partes do equipamento, ajudando a diminuir qualquer fundo, conforme observado nestes gráficos. O ajuste inadequado, representado pela linha magenta, aumentou significativamente a formação de óxidos em m mais 16 em comparação com a amostra devidamente ajustada, conforme demonstrado pela linha azul-escura. Isso tem o efeito de diminuir ligeiramente os sinais desejados em m e aumentar significativamente a interferência de fundo indesejada em m mais 16.

A lavagem adequada e a diluição apropriada das amostras em água Milli Q garantirão um fundo mínimo e a maior resolução de células, equilibrando a necessidade de velocidade. Semelhante aos dados de um experimento representativo mostrado aqui neste experimento, esferas de poliestireno contendo lantânio 139 ODIUM 140, térbio 159, DIUM 169 e lutécio 175 em abundância natural foram analisadas no modo de aquisição celular. Os dados foram analisados usando o FlowJo e os detritos provenientes de esferas quebradas foram excluídos por geração.

Determinou-se que a amostra devidamente ajustada estava na vazão de 0,74 litros por minuto, conforme representado pela linha azul-escura. Intensidades de sinal mais altas foram observadas nesta vazão em comparação com vazões mais baixas, e observou-se que essa amostra devidamente ajustada apresentava sinal mais alto nas massas metálicas M e sinal mais baixo nas massas de óxido m + 16 do que os sinais inadequadamente ajustados. Um detalhe do sinal nas massas M LANTÂNIO 1 39 e TÚLIO 1 69 é mostrado aqui.

Observe que a taxa de fluxo do gás de makeup afeta mais a intensidade do sinal do LANTÂNIO 1 39 do que a intensidade do sinal do túlio 1 69. Esses gráficos mostram o sinal em m mais 16 massas de óxido 1 55 e 180 5, correspondentes aos óxidos de LANTÂNIO 1 39 mais OH 16 e túlio 1 69 mais OH 16, respectivamente. Observe que a taxa de fluxo do gás de makeup aumenta muito mais o sinal da massa 1 55 do que o sinal da massa 180 5, pois o lantânio 1 39 é mais facilmente oxidado do que o túlio 1 69.

As intensidades dos sinais m e m mais 16 em função da taxa de fluxo do gás de compensação são mostradas aqui. Os ícones preenchidos representam a massa M, enquanto os ícones vazados representam a massa M mais 16. As cores das linhas correspondem à respectiva massa M. Observe que as intensidades dos sinais de LANTÂNIO 139 e PRASEODÍMIO 141 são altamente afetadas pela taxa de fluxo do gás de compensação, chegando mesmo a um ponto em que há mais óxido de massa M mais 16 presente do que a massa M. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como ligar corretamente o CyTOF, ajustá-lo adequadamente, executar suas amostras e, finalmente, limpar e desligar corretamente o equipamento ao final das suas sessões diárias.