Análise e construção de estruturas de Ácido Nucleico com 3DNA

O objetivo geral deste procedimento é disponibilizar o conjunto de programas 3D NA para cientistas laboratoriais e outros pesquisadores investigarem a organização espacial do DNA e do RNA com ferramentas computacionais de última geração. Isso é realizado primeiramente baixando o software do fórum 3D NA e instalando-o em um computador local. O segundo passo consiste em analisar uma estrutura representativa de DNA ao nível dos degraus dos pares de bases constituintes.

Em seguida, a mesma estrutura de DNA é modificada ao nível do par de bases e depois reconstruída utilizando os novos parâmetros definidos para o par de bases. O passo subsequente é a análise de um grande conjunto de estruturas relacionadas. O passo final é o alinhamento de um conjunto de estruturas de DNA relacionadas em um referencial comum, a fim de visualizar as distorções globais das estruturas.

No fim das contas, as ferramentas 3D NA são usadas para examinar como etapas individuais de pares de bases, incluindo aquelas ligadas a fármacos e proteínas, contribuem para a conformação tridimensional do DNA e para identificar os sítios e direções de distorções globais significativas. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes é que o software é robusto e amplamente aplicável a uma variedade de estruturas diferentes contendo ácidos nucleicos. O método pode ajudar a responder perguntas fundamentais em bioquímica e biofísica, como a forma como os genomas são organizados em três dimensões e que tipo de deformação o DNA pode adotar.

Para iniciar a instalação do pacote de software, conecte-se ao site da DA três em xthreed.org e clique no link para o fórum 3D NA dentro do fórum. Selecione o link de registro e siga as instruções para criar uma nova conta.

Uma vez que um nome de usuário e senha tenham sido estabelecidos, faça login no fórum, selecione o link de downloads na seção de boas-vindas e, na nova página, escolha o download do 3D NA. Dê um clique duplo no arquivo tar gz para criar uma pasta denominada X 3D NA dash V 2.1, que contém o software 3D NA. Abra o aplicativo de terminal, normalmente encontrado em utilitários em um Macintosh, e altere para o diretório X 3D NA dash V 2.1.

Execute o script de configuração necessário para o funcionamento adequado do 3D NA. Todos os comandos utilizados neste vídeo podem ser encontrados no protocolo textual. Em seguida, copie as configurações de exportação em duas linhas que aparecem impressas na tela.

Se o usuário tiver colocado o software no diretório de aplicativos, as duas linhas devem aparecer conforme mostrado aqui. Abra o aplicativo de edição de texto encontrado no diretório de aplicativos. No menu Formato, selecione Tornar texto simples.

Se um arquivo BRC existir, abra o arquivo em modo texto, edite e cole as configurações de exportação no final do arquivo. Caso contrário, se nenhum arquivo bash RC existir, cole as configurações de exportação em um arquivo em branco e salve com o nome de arquivo bash RC no diretório inicial. Para que as novas configurações fiquem disponíveis, execute o arquivo Bash RC recém-salvo dentro do programa de terminal.

Este vídeo demonstra a análise de uma estrutura representativa de ácido nucleico, o DNA ligado à proteína HBB da bactéria Borrelia burgdorferi. O primeiro passo na análise 3D do NA é a criação de um arquivo que liste todas as bases pareadas. Isso é feito digitando um comando para aplicar o programa FindPairs à estrutura atômica armazenada no arquivo np2.mp2.pdb.

O próximo passo na análise é determinar os parâmetros geométricos que caracterizam a estrutura. O comando analyze utiliza como entrada o arquivo de pares de bases e cria vários arquivos de saída que aparecem no diretório de trabalho. Os valores geométricos podem então ser calculados digitando, analyze two MP two bps.

Os arquivos de saída gerados incluem dois MP dois out, que contém uma visão geral dos parâmetros calculados, e bpco step par, que contém uma lista dos parâmetros do corpo rígido. Além da análise de uma estrutura de ácido nucleico, o software 3D NA oferece a capacidade de construir um modelo estrutural a partir de parâmetros de corpo rígido utilizando o comando rebuild, a fim de criar um modelo atômico aproximado, que inclui coordenadas para os átomos da estrutura da base e do esqueleto. Digite o comando listado no texto. Este comando instrui o 3D NA a introduzir uma conformação padrão de esqueleto BDNA na construção de modelos a partir de parâmetros de corpo rígido.

Pode-se então construir um modelo de dupla hélice com os parâmetros de corpo rígido encontrados na estrutura H-B-B-D-N-A digitando o comando apropriado. O arquivo de parâmetros bpco pode ser editado para gerar uma estrutura modificada. Aqui, os ângulos de rolamento extremos formados nos dois sítios de maior curvatura são modificados.

A estrutura é então construída com o conjunto modificado de parâmetros do passo como arquivo de entrada. Os dois modelos podem ser visualizados com um visualizador molecular padrão, em contraste com a análise de uma estrutura contendo um único ácido nucleico. Esta parte do vídeo mostrará como analisar um grande conjunto de estruturas em um conjunto de arquivos, começando com os nomes MD_sublinhado_conjunto_um_PDB e terminando com um número.

O primeiro passo na análise é a identificação das bases emparelhadas obtidas pela execução do programa find pair como antes, já que todo o conjunto de estruturas compartilha o mesmo esquema de emparelhamento de bases, sendo necessário executar o find pair uma única vez em um arquivo representativo aqui, o arquivo que termina com 1001. Isso gera as informações de emparelhamento de bases e as armazena no arquivo MD at set one BPS PS. O próximo passo encontra os parâmetros geométricos de todo o conjunto de estruturas utilizando o comando X 3D ncore ensemble.Analyze. Em seguida, os parâmetros de corpo rígido desejados podem ser extraídos do arquivo de saída geral MD at set one out.

Isso é realizado utilizando o conjunto de extração Command X três DCO. Os ângulos de rolamento são extraídos e é criado um arquivo de texto separado por vírgulas contendo os ângulos de rolamento. Esse arquivo pode ser lido por outros programas para análises e plotagens adicionais.

A versão mais recente do 3D NA possui um novo recurso que permite ao usuário visualizar múltiplas estruturas a partir de uma perspectiva comum. O comando reorientar do conjunto X three DCO sobrepõe uma coleção de estruturas relacionadas em um par de bases ou passo de par de bases comum, conforme em protocolos anteriores. O primeiro passo é calcular o emparelhamento de bases do DNA com o programa find pair.

Neste caso, o arquivo de entrada é composto por dois arquivos pdb do KEK contendo as 10 estruturas do operador CIA coli, O 3D NA ligado ao domínio de ligação do DNA da proteína Repressora LAC. O comando X three DCO ensemble reorient alinhará os modelos individuais em uma estrutura com múltiplos modelos em um referencial comum. Este comando exige como entrada tanto o arquivo PDB quanto o arquivo de emparelhamento de bases do passo anterior.

Também incluída no comando está a identidade do par de bases em relação ao qual todas as estruturas são alinhadas. A interface web W 3D NA inclui alguns recursos populares do pacote de software 3D NA. Esta parte do vídeo destaca a capacidade de construir modelos tridimensionais de DNA associado a proteínas utilizando o servidor web.

O primeiro passo para construir um modelo de DNA decorado com proteína é visitar o site W 3D NA localizado em W three d.rutgers.edu. A seleção de reconstrução no menu na parte superior esquerda da página ativa as funcionalidades online de construção de modelos. O próximo passo é selecionar o link do modelo de DNA com proteína ligada, encontrado na caixa levemente sombreada no centro da nova página.

Esta seleção ativará um menu suspenso, que permite ao usuário especificar o número de proteínas ligadas. A seleção do número de proteínas ligadas leva a uma nova página de especificação. O usuário pode então digitar ou colar a sequência desejada.

Na caixa de texto, no centro da nova página, há um menu suspenso abaixo da caixa de texto para selecionar a conformação helicoidal das regiões não ligadas do DNA. Há uma caixa de texto próxima à parte inferior da página de especificações para inserir as posições de ligação e os nomes dos arquivos das proteínas ligadas. A posição de ligação especifica a localização do centro do fragmento da proteína ligada na sequência de DNA.

No final da página de especificações, há uma caixa que permite ao usuário gerar uma pré-visualização do DNA ligado à proteína. Neste caso, essa caixa está marcada e o botão continuar é clicado. Essa ação gera uma página de revisão listando os parâmetros selecionados, bem como quaisquer erros que possam ter surgido da sobreposição dos sítios de ligação selecionados.

O usuário pode selecionar o botão de voltar caso alguma alteração precise ser feita, ou o botão de montagem para prosseguir. A próxima página exibe uma imagem estática do complexo proteína-DNA em sua configuração mais estendida e permite a visualização interativa online por meio da web. O usuário também pode baixar um arquivo contendo as coordenadas atômicas.

As ferramentas de software 3D NA são rotineiramente utilizadas para analisar estruturas de ácidos nucleicos. Os valores dos parâmetros do corpo rígido revelam distorções na estrutura tridimensional, como os dois sítios de dobramento extremo do DNA para o sulco maior com grandes ângulos de rolamento positivos encontrados nas etapas 13 e 22. No complexo cristalino de DNA com a proteína RHBB de Borrelia Bergdorf.

A capacidade do software de reconstruir estruturas a partir dessas quantidades torna possível determinar como etapas individuais de bases e pares de bases contribuem para a conformação molecular geral. Como ilustrado aqui, a curvatura global do DNA induzida por HBB reflete mais do que as duas distorções extremas de rotação mencionadas acima. O DNA permanece altamente curvado quando reconstruído com essas etapas de pares de bases alinhadas.

Isso ocorre quando os dois maiores valores do papel foram definidos como zero. A nova funcionalidade em NA 3D para examinar grandes quantidades de estruturas relacionadas torna possível extrair padrões dependentes da sequência e do tempo nos arranjos espaciais de moléculas de DNA e RNA simuladas. Por exemplo, a coloração amarela dos ângulos de rotação entre pares de bases sucessivos em dois grandes conjuntos de estruturas de DNA simuladas revela a flexão preferencial dessas moléculas em degraus de pares de bases de purina do Permiano.

Os valores mais elevados de rolamento, representados em vermelho, que persistem por curtos períodos nas extremidades do DNA, sugerem um derretimento localizado e um dobramento novamente da estrutura da dupla hélice. Os padrões variacionais de outros parâmetros de corpo rígido, como os ângulos e distâncias entre bases complementares, podem ajudar a decifrar as distorções estruturais precisas. A capacidade do software 3D NA de reorientar moléculas relacionadas em um referencial comum revela características da estrutura geral ocultas em muitos dos arquivos armazenados no banco de dados de proteínas.

Por exemplo, o alinhamento convencional de estruturas relacionadas com base no ajuste da raiz quadrada média dos átomos correspondentes produz uma série de trajetórias espaciais semelhantes que se sobrepõem aproximadamente umas às outras aqui, os 10 modelos baseados em RMN do operador de DNA O3 de Esia coli ligado aos domínios N-terminais da proteína repressora LAC; o posicionamento conjunto dessas mesmas estruturas em um referencial coordenado comum no par de bases da extremidade 5' de cada dupla hélice revela distorções acentuadas na estrutura global, nas quais as moléculas se flexionam em direções apreciavelmente diferentes. A variabilidade estrutural pode influenciar a facilidade com que a proteína repressora LAC de CIA coli se liga ao O3 e induz um looping entre o O3 e operadores distantes em sequência no operon LAC. Como ilustrado aqui, o posicionamento preciso de uma proteína arquitetônica como a HBB de Borrelia burgdorferi pode ter um efeito dramático na conformação geral do DNA.

Se duas cópias da estrutura conhecida de alta resolução estiverem separadas por 43 pares de bases, um fragmento de DNA de 81 pares de bases se fecha em uma configuração apertada, quase circular. Se as duas proteínas estiverem separadas por cinco pares de bases adicionais, o DNA segue um trajeto aberto e sinuoso. Os arranjos muito diferentes da dupla hélice decorada com proteínas mostram como o espaçamento de proteínas arquitetônicas pode afetar a ciclização ou a formação de alças no DNA após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área da biologia estrutural de ácidos nucleicos explorarem interações entre DNA e proteínas, dobramento de RNA e o design de nanopartículas, com o objetivo de obter uma compreensão mais profunda de defeitos no desenvolvimento e doenças como o câncer, além de projetar novos tratamentos terapêuticos.