Preparação de linhagens de células para Knockdown condicional da expressão gênica e mensuração dos efeitos Knockdown em E4orf4 morte celular induzida por

O objetivo geral do experimento a seguir é observar o efeito do silenciamento de ACF um ou SNF dois H sobre a morte celular induzida por E quatro ou quatro. Isso é alcançado pela geração de linhagens celulares nas quais a expressão de srna para ACF um ou SNF dois H é ativada condicionalmente pela adição de doxiciclina, resultando em níveis reduzidos da proteína ACF um ou SNF dois H. Em um segundo passo, células dessas linhagens são tratadas com doxiciclina para reduzir a express combustão de ACF um ou SNF dois H ou são mantidas sem tratamento.

A seguir, o E quatro ou quatro é expresso nas células com ou sem ACF um ou SNF dois H resistentes a S-H-R-N-A. A fim de investigar o efeito da ACF um ou SNF dois H sobre a morte celular induzida por E quatro ou quatro, são obtidos resultados que mostram o impacto dos níveis de ACF um ou SNF dois H na toxicidade do E quatro ou quatro, com base na contagem de núcleos com morfologia apoptótica utilizando o ensaio JY. A principal vantagem desta técnica em relação a outros métodos, como a transfeção transitória de RNAs, é que todas as células expressam o S-H-R-N-A e a porcentagem de células coexpressando juntamente com o plasmídeo tradicional é maior. Este método fornece informações sobre os mecanismos subjacentes à morte celular induzida por if 4 0 4, mas também pode ser aplicado ao estudo de outras proteínas protéicas.

Além de Ana Lafe, um pesquisador do meu laboratório demonstrará partes deste procedimento. Para iniciar o procedimento de geração de linhagens celulares induzíveis, plaque células T-Rex 293 em uma densidade de aproximadamente cinco vezes 10 elevado às seis células por placa de 10 centímetros em oito mililitros de DMEM contendo soro sem tetraciclina e cinco microgramas por mililitro de blástico. Incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, substitua o meio por oito mililitros de meio fresco antes da transfeção. O plasmídeo para transfeção é o plasmídeo pSuperior-neo plus GFP, codificando ACF1 ou SNF2H-S-H-R-N-A, sob controle de um promotor H1 induzível por tetraciclina, bem como o gene de resistência à neomicina fundido ao GFP e sob controle de um promotor constitutivo PGK.

Adicione 10 microgramas de DNA plasmidial a 500 microlitros de cloreto de sódio 150 milimolar e agite em vórtex. Em seguida, adicione o reagente jet PY na proporção de dois microlitros por micrograma de DNA a outro tubo contendo 500 microlitros de cloreto de sódio 150 milimolar e agite em vórtex. Adicione a solução jet pie ao DNA e misture bem por vórtex.

Incube-o à temperatura ambiente por 15 minutos. Após 15 minutos, pipete suavemente os complexos de DNA sobre as placas de 10 centímetros contendo 70 a 80% de confluência. As células T-Rex 2 9 3 serão misturadas no dia seguinte.

Substitua o meio por um meio seletivo, neste exemplo DMEM como antes, contendo 500 microgramas por mililitro de G 418. Durante as próximas duas semanas, monitore as células. Substitua o meio seletivo por um meio fresco semelhante a cada três ou quatro dias até que apareçam colônias.

Identifique as colônias a olho nu e marque sua localização na parte inferior da placa usando uma caneta colorida. Verifique ao microscópio se as colônias estão bem separadas. As colônias podem ser isoladas quando atingirem um tamanho suficiente para serem visualizadas sem microscópio.

Para o sucesso deste procedimento, é importante escolher colônias bem separadas durante o isolamento de colônias. Em uma cabine estéril, aspire o meio da placa. Enxágue suavemente com PBS e aspire completamente todo o líquido remanescente.

Adicione três microlitros de tripsina a 0,25% em EDTA a uma colônia na placa, pipetando a tripsina repetidamente até que as células se desprendam da placa. Transfira as células para meio seletivo em um poço de uma placa de 24 poços. Repita este procedimento para várias outras colônias na placa.

Cultive as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até que preencham o poço. Em seguida, divida as células de cada colônia original em três poços separados em uma placa de 12 poços distinta e incube durante a noite no dia seguinte. Substitua o meio em uma placa por meio contendo um micrograma por mililitro de doxiciclina, proveniente de uma solução estoque preparada em água duplamente destilada.

Substitua o meio em uma placa controle por meio sem doxiciclina. Incube as células a 37 graus Celsius, 5% dióxido de carbono, por 72 horas. Células de uma poça tratada e de uma poça não tratada são então colhidas para análise por western blot a fim de determinar a eficiência do silenciamento de ACF um ou SNF dois H. Um resultado representativo é mostrado aqui.

Esta membrana foi corada com anticorpos contra SNF duas H e alfa tubulina. Esta última serviu como controle de carga para os dois clones. Os números quatro e cinco mostraram uma forte redução em SNF duas H após a indução com doxiciclina e foram, portanto, escolhidos para uso no experimento de silenciamento gênico, que será demonstrado no próximo segmento.

As células não tratadas na terceira placa serão utilizadas para expandir a linhagem celular selecionada, e alíquotas dessas células serão posteriormente congeladas. Para uso posterior na indução do silenciamento de ACF um ou SNF dois em células da placa H em meio seletivo em placas de 10 centímetros, adicione doxiciclina na concentração de um micrograma por mililitro em metade das placas e incube a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, por 48 a 72 horas. Cada grupo de placas deverá fornecer células para 12 placas de seis centímetros, incluindo duas réplicas para o ensaio DPI para cada ponto, bem como uma placa para análise por western blot de cada amostra.

48 a 72 horas após a indução, trypsinize as células de cada grupo e, após contá-las, semeie 1,5 vezes 10 à sexta potência de células por placa de seis centímetros no mesmo meio, com ou sem doxiciclina. Incube as células a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, durante a noite; no dia seguinte, transfete as células conforme indicado.

Tanto as células não tratadas quanto as tratadas com doxiciclina são transfectadas em triplicata de quatro maneiras: uma com um plasmídeo vazio e um plasmídeo que expressa GFP; duas com o plasmídeo vazio e um vetor que expressa ACF um resistente à SHRA GFP ou SNF dois HGFP; três com um plasmídeo que codifica E quatro ou quatro e um plasmídeo que expressa GFP; e com o plasmídeo que codifica E quatro, todos os quatro. Após a transfeção, incuba-se todas as placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante a noite.

No dia seguinte à transfeção das células, extraia proteínas de uma placa por amostra para análise por Western blot, a fim de verificar se ACF um ou SNF dois H foi eficientemente silenciado e se E quatro ou quatro foi expresso igualmente nas diferentes amostras. As 16 placas restantes serão utilizadas para o ensaio DPI. Aspire o meio das placas destinadas ao ensaio DPI e lave as células suavemente com PBS em uma capela química.

Adicione um mililitro de paraformaldeído 4% preparado em PBS para cobrir as células e incube por 15 minutos à temperatura ambiente sem agitar. Aspire o paraformaldeído e lave com PBS agitando à temperatura ambiente por cinco minutos. Repita a lavagem mais duas vezes, totalizando três lavagens; após a terceira lavagem com PBS, adicione etanol 80% mantido a menos 20 graus Celsius e incube a menos 20 graus Celsius por pelo menos uma hora.

Aspire o etanol e lave as células duas vezes com PBS, agitando à temperatura ambiente por cinco minutos cada vez; depois, lave uma vez por cinco minutos à temperatura ambiente com PBS contendo 0,5% de BSA e 0,05% de Tween 20 ou P-B-S-B-T. Realize também com agitação para prevenir a ligação inespecífica de anticorpos. Bloqueie as células em um mililitro de tampão P-B-S-B-T contendo 10% de soro de cabra por 20 minutos, sob agitação à temperatura ambiente.

Em seguida, lave as células duas vezes em P-B-S-B-T, cinco minutos cada lavagem. Incube as células com o anticorpo primário, um anticorpo específico para E quatro ou quatro neste caso, em um mililitro de P-B-S-B-T por uma hora sob agitação à temperatura ambiente. Em seguida, lave duas vezes em P-B-S-B-T e uma vez em PBS contendo 0,1% de BSA, cinco minutos cada lavagem.

Em seguida, adicione às células um mililitro de PBS com 0,1% de BSA contendo o anticorpo secundário fluorescente adequado e 0,5 microgramas por mililitro. Incube com concentração final de DPI por 40 minutos sob agitação, à temperatura ambiente e no escuro. Por fim, lave com PBS por cinco minutos.

Seque o poço por aspiração e mantenha as placas viradas para baixo por mais uma hora até a noite toda para obter secagem completa e cubra com lâminas de montagem de alumínio sobre as células usando solução de montagem Flora Mount G. Mantenha as placas a quatro graus Celsius no escuro até o momento de contagem. As células com núcleos apoptóticos que sofreram os diversos tratamentos descritos no protocolo foram fixadas e coradas com anticorpos específicos E four ou four e DPI para visualizar os núcleos das células transfectadas.

Esta figura mostra um exemplo de células expressando E quatro ou quatro e GFP. O painel A mostra a expressão da proteína GFP controle isoladamente, e o painel B mostra a expressão de E. quatro ou quatro. Os núcleos corados com DAPI são mostrados no painel C e as imagens sobrepostas são mostradas no painel D. As setas brancas indicam células transfectadas com GFP e E. quatro ou quatro contendo núcleos com morfologia apoptótica. As setas vermelhas indicam núcleos com formas irregulares que não são contados como núcleos apoptóticos. O asterisco marca núcleos mitóticos ou núcleos que acabaram de se dividir. O número de núcleos condensados ou fragmentados visualizados pela coloração com DAPI foi contado para calcular a porcentagem de núcleos com morfologia apoptótica dentro da população de células transfectadas, a fim de manter a objetividade ideal do teste.

A contagem de núcleos apoptóticos nas diversas amostras foi realizada de forma cega, na qual a pessoa que realizava a contagem não tinha conhecimento da identidade das amostras. Um resultado representativo é mostrado neste gráfico. Percentuais mais elevados de anormalidades nucleares foram observados em células que expressam E4/4, confirmando que o T4/4 induz a morte celular. O maior percentual de anormalidades nucleares foi observado em células que expressam E4/4 nas quais os níveis de ACF1 foram reduzidos por meio de silenciamento mediado por shRNA, indicando que o silenciamento de ACF1 potencializa a morte celular induzida por E4/4, aumentando a toxicidade de E4/4 nas células.

Expressar baixos níveis de ACF não resultou de um aumento nos níveis de E quatro ou quatro, conforme observado no Western blot. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de facilitar uma contagem aconselhada de núcleos apoptóticos com DPI e aplicar critérios rigorosos para a identificação desses núcleos. Além deste procedimento, outros métodos, como ensaios clonogênicos, podem ser realizados para validar os resultados da DA pse após este procedimento.

Outros métodos, como ensaios de coimunoprecipitação, podem ser realizados para responder perguntas adicionais. Por exemplo, se existe uma interação física entre as proteínas investigadas.