Luz Ensaio Preferências para estudar inata e circadiano Photobehavior Regulamentado Drosophila As larvas

O objetivo geral do experimento a seguir é testar o comportamento fotográfico inato e circadiano da lava drosófila por meio de um teste de preferência claro-escuro. Isso é conseguido primeiro criando as larvas experimentais sob condições claras e escuras definidas para estabelecer um relógio circadiano inicial nas larvas. Em seguida, as larvas são trocadas para escuridão constante, o que permite que o relógio circadiano larval funcione livremente.

Uma vez no estágio de alimentação L três, a lava é classificada em grupos para testar sua preferência de luz em diferentes pontos de tempo circadianos. São obtidos resultados que mostram a preferência inata e circadiana pela luz com base no cálculo de um índice de preferência e na comparação entre pontos de tempo e grupos experimentais. Embora esse método possa fornecer informações sobre a regulação inata e circadiana da detecção de luz e o processamento do comportamento da foto, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como olfato, cassação, quimioterapia, termotaxis.

Da mesma forma, pode ser modificado para testes de aprendizagem e memória. Demonstrando o procedimento estarão Alina e BMA Para alunos de pós-graduação do meu laboratório Para coletar ovos, permita que as moscas adultas acasaladas coloquem por 12 horas em arquivos frescos e transfira-os para novos frascos. Continue transferindo os adultos a cada 12 horas para um ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão.

Mantenha as coleções de ovos de 12 horas na incubadora. Para o experimento, criar os animais no estágio inicial de larva L três. Estes são alimentadores disponíveis de 84 a 108 horas a partir do ovo.

O estadiamento correto do LAE é fundamental para o sucesso do experimento. Desde o final do L três, o LAE mudou o comportamento da foto para testar os componentes circadianos do comportamento visual. 48 horas antes do teste e pouco antes do subjetivo das larvas, amanhecer, colocar as larvas coletadas em uma caixa de papelão.

Em seguida, transfira a caixa para uma incubadora de escuridão constante por 48 horas até o experimento, essas larvas devem permanecer intactas em seu espaço dedicado. Prepare a tampa de uma placa de Petri de nove centímetros usando um quadrado de 20 centímetros dividido em quatro quadrantes. Como um guia.

Cole quadrados de 10 centímetros de papel alumínio em quadrantes opostos e cubra-os com fita preta. Certifique-se de cobrir a borda da tampa. Em seguida, cola, Um quadrado de 20 centímetros dividido em quatro quadrantes sob a fonte de luz sobre a mesa.

Marque a circunferência de um prato de teste na folha para atuar como um guia para um deslocamento consistente. Instale uma lâmpada LED acima da placa de Petri usando um suporte de ferro. Ajuste a altura de forma que toda a placa de teste fique homogênea iluminada.

Ajuste a intensidade da luz em um local de teste para entre 350 e 760 luxe, ajustando ainda mais a altura da lâmpada ou usando uma fonte de alimentação ajustável. A sala de experimentos precisa de iluminação de luz vermelha e deve ter a mesma temperatura de onde os animais são criados. Os frascos foram criados por dois dias sob escuridão constante.

Colete a lava em sua comida com uma espátula dos cinco milímetros superiores da comida. Espalhe a comida no lado externo da tampa de uma placa de Petri. Adicione um pouco de água à comida e misture delicadamente com a espátula.

Adicione uma gota de água da torneira a um novo prato usando um pincel. Transfira as larvas para a gota d'água para lavá-las. Em seguida, use um pincel úmido para coletar as larvas usando o pincel úmido.

Selecione apenas as larvas de L três de alimentação precoce e evite larvas de L três errantes tardias. Transfira as larvas selecionadas para o centro de uma placa de teste. Alimentando-se com L, três larvas têm esféricas anteriores abertas e salientes para o exterior.

Em forma de dedo. As esféricas posteriores têm três aberturas cada e quatro grupos de grandes pêlos ramificados. As glândulas salivares se estendem até o segundo segmento abdominal.

Depois de colocar 30 larvas no centro da placa de teste, cubra-a com a tampa preparada. Ligue a lâmpada LED. Inicie um cronômetro e deixe as larvas se moverem livremente no prato por cinco minutos.

Em seguida, remova rapidamente a tampa e conte o número de larvas nos quadrantes escuro e claro. Marcar a posição de cada lava pode facilitar a contagem. Uma fotografia rápida também pode ajudar as larvas que mostram preferência de luz pouco clara, como larvas rastejando nas paredes ou tomando emprestado em ágar, devem ser contadas como preferência neutra e adicionadas ao número total de larvas quando o índice de preferência de luz é calculado.

Depois de contar as larvas, descarte a placa e use uma nova placa de teste para o próximo experimento. Após a realização de 10 a 15 ensaios por genótipo, prossiga com a análise seguindo o protocolo. A preferência clara e escura da lava de Cantão ES foi comparada em dois tempos circadianos diferentes.

CT zero e CT 12, subjetivamente, as larvas do amanhecer e do anoitecer ou gemem por 48 horas em condições padrão e depois mudam para escuridão constante por três dias. O teste de luz escura abaixo de 350 luxe revelou que a fotossensibilidade à luz foi maior nas larvas testadas no CT zero em comparação com as larvas testadas no CT 12. Usando esta fórmula, a preferência de escuridão da lava CT zero foi de 0,52 em comparação com 0,36.

As larvas CT 12 comparando os índices usando um teste de wilcoxon produzem valor de P significativo de 0,023. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como testar a preferência de luz da larva do trófico em diferentes circuitos e pontos de tempo para esse objetivo. Você deve ser capaz de arrastar no estágio F três larvas de oph, testar seu comportamento fotofóbico e calcular o índice de preferência de luz para comparação estatística.