Tripsina Digest protocolo para analisar a vascularização da retina de um rato modelo

O objetivo geral deste procedimento é isolar a rede vascular da retina. Isso é feito realizando primeiro uma série de lavagens com água na retina isolada. Na segunda etapa, a retina é digerida em tripsina a 37 graus Celsius por cerca de uma a uma hora e meia, dependendo do tamanho da retina.

Em seguida, a vasculatura é isolada por meio de lavagens adicionais com água e dissecção ao microscópio. Em última análise, alterações vasculares patológicas, como microaneurismas, degeneração capilar e proporção anormal de células endoteliais para parasitas, podem ser visualizadas. Portanto, a principal vantagem de tentar digerir sobre os métodos existentes, como a preparação de montagens planas de retina, é que toda a rede vascular pode ser destacada com grande clareza.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque é tecnicamente desafiador e difícil de executar de forma consistente. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de isolamento vascular são difíceis de aprender apenas com palavras. Esta é uma ferramenta muito valiosa em qualquer laboratório que esteja realizando estudos de biologia vascular da retina, como algumas doenças como a retinopatia diabética, demonstrando essa técnica estará Jonathan Chow, um talentoso estudante de medicina do meu laboratório.

Depois de fixar o olho de camundongo enucleado e a formana tamponada a 10% neutra por 24 horas, coloque o olho em uma placa de Petri e cubra-o com uma pequena quantidade de água. Comece a dissecção usando uma tesoura de dissecção para fazer cuidadosamente um corte inicial na córnea. Em seguida, enquanto segura a área cortada com uma pinça reta, use uma tesoura para cortar ao longo da borda da córnea e a esclera removendo a córnea.

Em seguida, use uma pinça fina, curva e reta. Descascar lenta e cuidadosamente a esclera e a coróide da retina em direção ao nervo óptico. Em seguida, remova o cristalino e qualquer excesso de íris e detritos da retina para ajudar a separar as camadas neurais da retina dos vasos sanguíneos.

Em aproximadamente 500 microlitros de água filtrada de 45 micrômetros para uma placa de 24 poços e coloque a retina em um poço, em seguida, agite suavemente por quatro a cinco horas em temperatura ambiente, trocando a água a cada 30 a 60 minutos. Continue a lavar a retina em água durante a noite com agitação suave Em temperatura ambiente no dia seguinte, remova a água e, a 3% de tripsina, verifique ao microscópio para garantir que nenhum detrito seja encontrado no poço. Para evitar que a vasculatura adira a ela, incube o tecido a 37 graus Celsius com agitação suave ou sem agitação por uma a uma hora e meia.

Quando o tecido começar a mostrar sinais de desintegração, coloque a placa no microscópio e evite a retina. Remova cuidadosamente a tripsina para separar a vasculatura. Primeiro, adicione água filtrada à retina usando uma pinça.

Retire a membrana limitante interna, que aparece como uma camada fina e transparente. Agite o prato com agitação suave. Após cinco minutos, coloque a placa no microscópio novamente e recoloque cuidadosamente a água, evitando danos à retina para ajudar a liberar a rede de vasos do tecido retiniano aderente.

Lave a retina como acabamos de demonstrar até que haja pouco ou nenhum resíduo restante na água após a última lavagem. Portanto, normalmente remover todo o tecido não vascular é a parte mais complicada do procedimento. As seguintes técnicas podem ser usadas em sequência ou individualmente Para facilitar o isolamento da rede vascular, uma dica importante é mergulhar todas as ferramentas e tripsina antes de manipular a retina.

Isso pode ajudar a evitar que um tecido adira ao equipamento. Cubra uma ponta de micropipeta de 200 microlitros com tripsina reservada e, em seguida, pipete cuidadosamente a água para cima e para baixo, adjacente e soprando em direção aos vasos da retina, causando agitação suave. Se o tecido não vascular ainda for resistente, uma micropipeta revestida com tripsina aponta para o nervo óptico e pipeta cuidadosamente toda a rede de vasos para cima e para baixo para ajudar a quebrar o tecido não vascular.

Finalmente, tudo bem. A pinça pode ser usada para levantar suavemente a vasculatura para fora da água para desalojar quaisquer componentes não vasculares de aderência. O resultado final deve ser uma rede de vasculatura retiniana intacta e livre de detritos.

Para visualizar a vasculatura, primeiro coloque uma gota de água em uma lâmina limpa. Em seguida, transfira os recipientes digeridos para a água sob uma verificação de escopo. Se o suporte da aba VAs estiver dobrado ou desdobrado, os vasos dobrados levam a pouca visibilidade.

Quando manchado, se o tecido estiver dobrado, adicione mais água e agite suavemente a lâmina para facilitar o desdobramento. Em seguida, use uma micropipeta para remover lentamente o excesso de água. O produto final de um procedimento bem-sucedido é uma montagem plana de toda a rede da vasculatura da retina do camundongo com a arquitetura mantida e corada com hemat, toin e eoin.

Como mostrado aqui, como visto nesta imagem, uma clara diferenciação entre as células endoteliais e os pericitos pode ser observada na retina. Os núcleos das células endoteliais, conforme indicado pela seta branca, são ovais ou alongados e encontram-se inteiramente dentro da parede do vaso. Os núcleos do parasita indicados pela seta preta são pequenos, esféricos mancham densamente e geralmente têm uma posição protuberante ao longo da parede capilar.

A tripsina e a digestão são um procedimento comum usado para analisar a patologia vascular em modelos animais diabéticos. Esta imagem mostra um exemplo de degeneração capilar indicada pela seta branca observada em um camundongo DB DB, um modelo para diabetes tipo dois. Embora este procedimento tenha sido otimizado para retinas de camundongos, resultados semelhantes também podem ser obtidos em retinas de ratos.

É importante notar que as retinas de ratos, como mostrado nessas imagens, são maiores que as retinas de camundongos e requerem 12 em vez de 24 placas. A rede vasculatura da retina do rato também é menos frágil do que sua contraparte de camundongo. É extremamente crucial remover o máximo possível do tecido não vascular.

Quaisquer remanescentes levarão a manchas inespecíficas e levarão a uma má visualização da vasculatura. Nesta imagem, por exemplo, pode-se observar uma remoção malsucedida de todo o tecido não vascular. Da mesma forma, também é importante que a retina seja desdobrada durante a montagem, de modo a melhorar a visualização da vasculatura.

Esta imagem mostra um desdobramento malsucedido da montagem plana vascular. Depois de dominar este procedimento tecnicamente difícil. Viagens e digestões podem ser um método extremamente valioso que permite uma visualização detalhada de toda a rede vascular.

Ao melhorar essa técnica no olho do camundongo, os pesquisadores podem aproveitar os camundongos geneticamente manipulados para estudar várias vias que podem assumir o controle da vasculatura retiniana e nos permitir entender a fisiopatologia de várias doenças da retina. Como resultado disso, podemos melhorar nossa compreensão das patologias de doenças, como a retinopatia diabética. Ao estudar modelos de camundongos como o camundongo DVDB, isso pode permitir a oportunidade de encontrar novas intervenções terapêuticas potenciais direcionadas à vasculatura da retina.