Estabelecimento de um In vitro Sistema para estudar o comportamento intracelular de Candida glabrata Em humanos THP-1 macrófagos

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer um sistema modelo de cultura in vitro para estudar o comportamento intracelular de um patógeno fúngico oportunista humano. Canida lab ratta em macrófagos derivados da linha celular monocítica humana TP um. Para conseguir isso, os monócitos THP um são primeiro tratados com quatro ésteres para diferenciá-los em macrófagos.

Em seguida, os macrófagos THP um são infectados com células GTA canida duas horas após a infecção. As células GTA da canida não fagocitadas são removidas por arruelas de PBS e as células e intracelulares são recuperadas para estudos posteriores por osmos de macrófagos infectados. Este protocolo pode ser usado para avaliar tanto as células GTA virais para canida em macrófagos, quanto a maturação de Ross faiz e a resposta de citocinas em THP em macro FIDS após infecção por candida GTA.

Além disso, este protocolo pode ser ampliado para rastrear a biblioteca mutante colaboradora de candida para perfis de sobrevivência alterados em macrófagos TSP um de maneira semi-alta. A principal vantagem deste protocolo é que ele é relativamente barato, altamente reprodutível e facilmente adaptável a diferentes células imunológicas, bem como patógenos fúngicos. Para iniciar o procedimento dois dias antes da infecção, trouxe THP e células monocíticas a 80% de CO no primeiro dia, retire o risco de cultura e, lentamente, suavemente para colocar todas as células sutis em suspensão.

Transferir a suspensão de células de monócitos DHP one para um tubo de centrifugação de 15 ml. Centrifugue a suspensão da pilha à temperatura ambiente por quatro minutos a 1000 RPM Deccan o meio em um recipiente de resíduos em cinco ml pré API meio no tubo e reus. Suspenda o pellet de uma célula THV pipetando suavemente o meio três quatro vezes.

Pegue 10 microlitros da suspensão celular para determinar a densidade celular usando um hemocitômetro e ajuste a densidade celular para 1 milhão de células por ml. Adicione um microlitro de uma solução estoque de PMA 60 micromolar à suspensão celular para que a concentração final seja de 16 anos molar e misture bem. Dispense um ml de suspensão celular correspondente a 1 milhão de células em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços e transfira-a para uma incubadora ajustada a 37 graus Celsius e 5% de CO2.

Após 12 horas de incubação, descarte o meio antigo. Adicione um ml de meio pré-RPI a cada poço e incube a placa por mais 12 horas. Essas células serão usadas para a infecção do Canadá, que será mostrada mais tarde.

Usando práticas microbiológicas adequadas, inocular uma única colônia de EA em um frasco contendo meio ML YPD. Incubar o flass por 14 a 16 horas em uma incubadora ajustada a 30 graus Celsius após a centrífuga de incubação. Uma cultura de ML a 4.000 RPM por cinco minutos.

Descarte o sup natin e lave as cascas três vezes com PBS estéril. Depois de descartar o tampão de lavagem, suspenda a paleta de células em um ml de PBS estéril por pipetagem suave. Em seguida, medir a absorvância da suspensão celular num espectrofotómetro a 600 nanómetros e ajustar a densidade celular para 2 milhões de células por ml com PBS.

Pegue 50 microlitros da suspensão celular e dilua cem vezes na placa de propagação PBS uma cultura de cem microlitros em meio YPD AGA. Incube a placa a 30 graus Celsius e conte o número de colônias que apareceram na placa YPD após um ou dois dias, multiplique esse número pelo fator de diluição apropriado para calcular as unidades formadoras de colônias de zero hora. Essas muitas unidades formadoras de colônias de Canada Reta serão usadas para infectar DHE em macrófagos.

Na próxima etapa, adicione 50 macro litros de suspensão de células clater do Canadá à camada mono de macrófagos em uma placa de cultura de 24 baleias. Solo a placa para distribuir uniformemente cada célula e incubar a 37 graus Celsius após duas horas de incubação. Rejeitar o meio invertendo a placa de cultura num recipiente para cada alvéolo da placa de cultura a ml de série PBS cuidadosamente ao longo do lado dos poços e rejeitar bem o tampão.

Repita esta etapa mais duas vezes. Em seguida, exceto para o primeiro poço, adicione um meio ML RPI a todos os outros poços, que pode ser usado para monitorar a replicação intracelular de células candidatórias em 4, 6, 12 e 24 horas após a infecção para recuperar células e intracelulares após duas horas de infecção por macrófagos, adicione uma água de cereal ML ao fos. Bem, depois de dois minutos, raspe o poço suavemente com a ponta de um flautista ML para remover os detritos de macrófagos do poço.

Enxágue o poço e colete o ly em um tubo de peixe macro centri. Prepare uma diluição de cem vezes de lisado de células microFIT em PBS e coloque cem microlitros em meio YPD AGA. Incube a placa a 30 graus Celsius por um a dois dias e conte o número de unidades formadoras de colônias.

Multiplique esse número com o fator de diluição apropriado para enumerar o número de células canidatoras que são fagocitadas por T dois e macrófagos após duas horas de infecção. Da mesma forma, o número de células ativadoras de cânida intracelulares pode ser determinado em diferentes pontos de tempo. A replicação pós-infecção e intracelular pode ser representada como um aumento nas 24 horas em comparação com as UFC internalizadas em duas horas mostradas aqui.

Outros resultados de um experimento típico em que o número total de células de jacaré de canida infectadas para TV um macrófagos é seis vezes 10, dois por quatro. O número de células recuperadas em duas horas é de 3,7, seis vezes 10,4. Ilustrando assim que as células e são fagocitadas a uma taxa de 62,66% durante o período de co-incubação de 24 horas.

Pode ter outras células além de uma replicação de 5,2 vezes, pois o número de células e intracelulares aumentou de 3,76 vezes 10,4 para 1,96 vezes 10,5. Neste experimento, a replicação intracelular de células TER canida também pode ser avaliada usando células E que expressam GFP enquanto microscópio confocal para isso. Prepare e infecte THV e macrófagos em uma lâmina de quatro câmaras usando o protocolo descrito anteriormente para a placa de cultura de 24 poços.

Duas horas após a infecção. Descarte o meio invertendo a lâmina em um recipiente de lixo a 500 microlitros PBS para cada câmara da lâmina. Enxágue bem e descarte o PBS.

Repita esta etapa mais duas vezes a 500 microlitros de 3,7% de altura formal para fixar as células. Incubar a lâmina à temperatura ambiente durante 20 minutos e rejeitar o formal de Altura. Lave cada preço de poço com 500 microlitros PBS para mobilizar macrófagos a 500 microlitros triton X após cinco minutos de incubação, remova Triton X e lave o poço com PBS.

Desmonte cuidadosamente a corrediça da câmara usando uma lâmina de remoção da câmara e um slide de ar rider. Coloque uma gota de meio de montagem Vector Shield contendo DPI em cada setor da lâmina, monte uma lamínula e sele as bordas com células visualizadas com tinta de unha sob um microscópio confocal. Aqui são mostradas as imagens confocais representativas de macrófagos TP um infectados com GFE expressando células laboratoriais de canida do tipo selvagem cerca de um aumento de seis vezes no número de células e intracelulares de duas a 24 horas é indicativo de replicação laboratorial de canida em TP uma abordagem de mutagênese de marca de assinatura de macrófagos é amplamente utilizada para identificar fatores de ulência em patógenos microbianos em que um grande número de mutantes é simultaneamente rastreado para defeitos de crescimento por meio de oligonucleotídeo exclusivo sequência de caracteres.

Aqui descrevemos nosso protocolo para a tela STM da Biblioteca do Canadá e da biblioteca mutante, que consiste em seguir três etapas. Primeiros 96 plasmídeos. Cada um abrigando uma pilha única de sequências de oligonucleotídeos é imobilizado em uma membrana de náilon.

Na segunda etapa, um pool de 96 mutantes do ator CANIDA é rastreado quanto a perfis de sobrevivência alterados em macrófagos THV um, seguido pela recuperação de YPD, células e mutantes e internalizadas de macrófagos, que serão referidas como amostras de entrada e saída, respectivamente. Por fim, as tags de assinatura de DNA são amplificadas por PCI e rotuladas por rádio a partir de amostras de DNA genômico de entrada e saída. O produto de PCR é hibridizado com tags exclusivas e os sinais radioativos na membrana são quantificados e analisados.

Para montar o aparelho de placa de 96 12 pontos, coloque uma membrana de náilon úmida em cima de um papel de árvore de vento úmido e aperte os parafusos da unidade. Lave a membrana com água estéril, seguida de uma lavagem com 0,4 mu de hidróxido de sódio. Transfira 200 nanogramas de solução de PLA BDNA do bloco 96 12 para os poços correspondentes do ponto de sangue apptus Após uma lavagem de hidróxido de sódio 0,4 molar.

Remova a membrana do aparelho de sangue de pontos após uma ferência em dois XXSC cruzando o BDNA plasmático transferido para a membrana em um reticulador UV. Incubar As membranas estão em pré-hibridização antenal, tampão e entrada e garrafas UNE por duas horas a 42 graus Celsius. Prepare sondas de nível de rádio por PCR usando DNA genômico extraído de paletas de células de entrada e saída e primers contra a região de flanco invertido de tags exclusivos.

Desnature as sondas de etiqueta de rádio a 99 graus Celsius por cinco minutos e coloque o gel no gelo. Transfira as sondas para garrafas de entrada e saída e incube por 14 a 16 horas a 42 graus Celsius. Pós-hibridização.

Lave as membranas de entrada e saída conforme descrito no protocolo. Retire as membranas das garrafas ao ar livre e exponha-as a uma tela de imagens de fosfo. Após duas a três horas, escaneie a tela de fósforo e adquira imagens.

Neste exemplo, dois filtros de membrana hibridizados são mostrados, o que representa a triagem de um pool de 96 mutantes de canida Gatory para sobrevivência alterada. Em três macrófagos, a quantificação e a determinação da razão entre a intensidade do sinal de cada ponto na saída e a membrana de entrada revelaram que os números de tag 13, 26, 75 e 85 estão sub-representados na saída. Essas pilhas são circundadas em vermelho e refletem o crescimento de quatro mutantes diferentes.

Em contraste, a pilha de mutantes com sequências exclusivas 11 e 81 destacadas em verde são super-representadas na amostra de saída. Em outras palavras, a partir desta tela, pool de 96 mutantes dois mutantes deve aumentar a sobrevida enquanto quatro mutantes exibem o crescimento em macrófagos. Os fenótipos de sobrevivência alterados identificados em tal triagem de piscina devem ser verificados em ensaios de infecção única.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como encenar e sistema oral in vitro para estudar o perfil de crescimento intra do patógeno fúngico de seu interesse. Além disso, você deve ser capaz de realizar a triagem de pools de mutantes em grande escala usando o sistema agora.