Abordagens para a frente genéticos em Chlamydia trachomatis

O objetivo geral deste procedimento é realizar análises genéticas em chlamydia tritus, realizando mutagênese química e determinando associações fenotípicas de genótipos. Isso é feito gerando primeiro cepas mutantes de chlamydia tracom usando mutagênese química. Em seguida, todas as mutações geradas por produtos químicos são identificadas por sequenciamento do genoma completo, seguido pela montagem do genoma guiada por referência.

Em seguida, as associações de genótipo de fenótipo nas cepas mutantes são identificadas. Finalmente, as associações fenotípicas de genótipos são confirmadas pela geração de cepas recombinantes e sua análise. Em última análise, os resultados podem ser obtidos mostrando que uma mutação em um determinado gene da clamídia leva a um fenótipo de interesse por meio de uma combinação de abordagens clássicas de mutagênese química e Singh de próxima geração.

Atualmente, não existem métodos disponíveis para substituição de genes na clamídia e as ferramentas de genética molecular para seu estudo estão em sua infância. Este método não requer transformação com DNA recombinante ou o desenvolvimento de ferramentas genéticas moleculares, mas atinge o mesmo objetivo. Essa é uma atribuição de função a produtos gênicos individuais.

Para preparar as células cultivadas, coloque aproximadamente uma vez 10 das seis células vir, por 25 centímetros quadrados, em três mililitros de DMEM suplementado com 10% de FBS, incube a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Quando as células atingirem a confluência cerca de 24 horas depois, aspirar o meio e infectar as células com clamídia em uma multiplicidade de infecção de cinco. Em um volume total de três mililitros de D-M-E-M-F-B-S contendo 200 nanogramas por mililitro de cicloheximida para iniciar a mutagênese 18 horas após a infecção sob uma capa química, prepare 20 miligramas por mililitro de etilmetano sulfonato ou EMS em PBS com cloreto de cálcio e cloreto de magnésio.

O EMS é um potente mutagênico e cancerígeno. Portanto, consulte o protocolo de texto para seu descarte. Aspire o meio das células Vero e lave-as uma vez com três mililitros de PBS com cloreto de magnésio e cloreto de cálcio.

Em seguida, a três mililitros de solução EMS e incubar por uma hora na capela de exaustão à temperatura ambiente. Após a incubação, remova o EMS e coloque-o em um recipiente com um hidróxido de sódio molar para inativar o mutagênico antes de lavar as células três vezes para remover qualquer EMS residual. Em seguida, a seis mililitros de DMEM 10% FBS com 200 nanogramas por mililitro de cicloheide e 25 microgramas por mililitro de gentamicina e incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 48 a 72 horas.

As inclusões parecem desprovidas de bactérias cerca de 36 horas após a mutagênese em 72 horas. Cerca de 10% das inclusões são preenchidas com bactérias, enquanto o restante permanece vazio para extrair corpos elementares ou EBS por lise hipotônica aspirar completamente o meio. Adicione um mililitro de água e rock por 10 minutos para desalojar as células, ligue as células pipetando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes.

Depois de coletar o lisado em um tubo de microfuga, adicione 0,25 mililitros de cinco x sacarose, tampão fosfato glutamato ou SPG a uma concentração final de um x e armazene a menos 80 graus Celsius. Defina monocamadas confluentes de células ves em seis placas de poços, semeando cerca de 0,4 vezes 10 das seis células em três mililitros de DMEM 10% FBS por poço, permitindo que as células formem uma monocamada homogênea nas próximas 24 horas. Em seguida, caia no gelo, uma solução estoque de clamídia mutagênica.

Em seguida, prepare seis tubos de diluição serial de dez vezes em um volume total de 200 microlitros por diluição em DMEM 10% FBS e coloque-os no gelo. Use três mililitros por poço de PBS para lavar as células Vero duas vezes. Em seguida, adicione três mililitros de DMEM a cada poço para placas de seis poços e 100 microlitros da diluição bacteriana em duplicata.

Gire o prato para garantir uma mistura uniforme. Gire as placas infectadas a 2.700 GS por 30 minutos a 15 graus Celsius. Em seguida, incube-os a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada de 5% de dióxido de carbono por uma a duas horas.

Enquanto isso, prepare 0,54% AROS em DMEM combinando primeiro os seguintes ingredientes e misturando. Bem, então misture 18,9 mililitros de estéril quente, 1,2% aros em água mexendo para evitar grumos. Mantenha a mistura quente em banho-maria a 55 graus Celsius.

Aspire a suspensão bacteriana da louça e adicione seis mililitros da solução aro quente. Deixe-o solidificar completamente à temperatura ambiente fora do exaustor. Em seguida, na coifa de biossegurança com as tampas removidas, seque as placas por mais 15 minutos quando as placas secarem, incube-as a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono por sete a 10 dias.

As placas devem ser visíveis com o auxílio de um microscópio de dissecação um dia antes do isolamento dos mutantes. Veja um vezes 10 elevado a quatro células zero em 100 microlitros por poço. Em uma placa de 96 poços, as células serão confluentes em 24 horas.

Sob um microscópio de dissecação, marque as placas a serem colhidas e, em seguida, use uma pipeta de barreira estéril de um mililitro para coletar os tampões de placas. Resus suspende as placas em 100 microlitros de DMEM suplementado com 10% FBS 400 nanogramas por mililitro, ciclo, heide e 50 microgramas por mililitro. Gentamicina para expandir as cepas mutantes, sobrepõe a suspensão em monocamadas confluentes de células Vero.

Gire as placas a 2.700 GS e 15 graus Celsius por 30 minutos antes de incubar os dbs de colheita quando mais de 50% das células estiverem infectadas, o que pode ocorrer 48 horas após a infecção e até 14 dias. Essa quantidade de células infectadas permite que bactérias viáveis suficientes sejam armazenadas para extrair EVs por lise hipotônica de células infectadas. Após aspirar o meio a 160 microlitros de água estéril e incubar em temperatura ambiente por 10 minutos.

Use pontas de barreira para romper as células pipetando para cima e para baixo várias vezes para garantir a lise completa. Por fim, transfira 160 microlitros de cada lisado para tubos de micro fuga. Adicione 40 microlitros de cinco XSPG e armazene a 80 graus Celsius negativos até que esteja pronto para testar e rastrear mutantes em busca de fenótipos de interesse.

A exposição ao mutagênico leva a inclusões que parecem desprovidas de bactérias, presumivelmente devido à morte celular bacteriana. Normalmente, o sorovar LGVL dois elimina completamente as células infectadas por piolhos dentro de 48 horas após a infecção, mas o tratamento com mutagênicos pode estender esse ciclo para mais de 90 horas, e espera-se que cerca de 10% das inclusões se recuperem em nossos experimentos. As células Vero infectadas tratadas com 20 miligramas por mililitro de EMS levaram a uma diminuição de 99% na recuperação da progênie infecciosa em comparação com os controles não tratados, como visto nesta figura.

O tratamento com mutagênicos também levou ao surgimento de placas com morfologias alteradas, incluindo pequenas placas. Outras morfologias incluem placas que parecem granulares, grumosas ou em forma de favo de mel, como mostrado aqui. As doses de EMS usadas nesses estudos podem levar a entre três a 30 mutações por genoma KCL, conforme avaliado experimentalmente por NGS.

Embora o EBS purificado por gradiente seja amplamente livre de material da célula hospedeira, o DNA do hospedeiro também é detectado e compreende cerca de 10 a 15% das preparações genômicas após este procedimento. Rastreios para fenótipos, como replicação prejudicada em células de cultura de tecidos, perda de atividades bioquímicas ou alteração de morfologias bacterianas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quais fatores bacterianos são necessários para a formação e manutenção da clamídia, fatores patogênicos.