Dissecção e montagem lateral de embriões Zebrafish: Análise de Desenvolvimento da Medula Espinhal

O objetivo geral deste procedimento é dissecar e montar embriões de peixe-zebra para uma visualização microscópica ideal da medula espinhal. Isso é feito primeiro dissecando e removendo a bola de carvalho. O segundo passo é remover os detritos de carvalho e pipetar os embriões em uma lâmina.

Em seguida, o excesso de líquido é cuidadosamente removido com um lenço Kim, seguido pela adição do meio de montagem. A etapa final é orientar os embriões na lâmina com um pôquer de embriões seguido da aplicação da lamínula. Em última análise, a fluorescência ou microscopia de campo claro é usada para mostrar a distribuição de corpos celulares pós-mitóticos e a trajetória do desenvolvimento de axônios.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurobiologia, como quais são os mecanismos responsáveis pela padronização, diferenciação e orientação do axônio. Embora esse método possa fornecer informações sobre muitos aspectos do desenvolvimento do sistema nervoso, ele também pode ser aplicado a outros tecidos, como o desenvolvimento muscular. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a dissecção ao microscópio é necessária antes de iniciar o experimento.

Faça um pôquer embrionário colando uma ponta de pipeta em uma pipeta anterior e, em seguida, colando uma linha de pesca na ponta da pipeta. Para iniciar a dissecção do embrião, coloque até 30 embriões de peixe-zebra. Idade 24 horas após a fertilização em uma placa de Petri de 35 milímetros preenchida com PBS.

Sob um microscópio de dissecação, prenda a cabeça de um embrião com um par de pinças enquanto puxa o carvalho com um alfinete de inseto. Em seguida, use o atiçador de embriões para mover os embriões para uma parte da placa de Petri que não tenha muitos restos de gema. Em seguida, aspire os embriões em uma pipeta de pastagem de vidro, puxando o mínimo de líquido possível.

Em seguida, pipete suavemente até 21 embriões em uma lâmina. Remova cuidadosamente o excesso de líquido usando um lenço de laboratório, evitando tocar nos embriões e, em seguida, adicione uma gota de meio de montagem aos embriões. Em seguida, use o pôquer de embriões para orientar os embriões de lado em duas a três fileiras.

Agora, adicione um pouco de vaselina em cada canto de uma lamínula. Vire a lamínula de forma que o lado com a vaselina fique voltado para baixo e coloque a lamínula em cima dos embriões. A vaselina atua para evitar danos aos embriões por compressão excessiva.

Bata suavemente na lamínula em cada canto até que a mídia de montagem toque na lamínula, se necessário, usando um pipetador na faixa de 20 a cem microlitros. Adicione mais mídia de montagem ao lado da lamínula e permita que a mídia adicionada absorva por baixo da lamínula. Agora, use um lenço de laboratório para limpar completamente ao redor da lamínula.

Não aplique pressão na lamínula, pois isso pode danificar os embriões quando devidamente limpos, a área está seca e não tem vaselina ou mídia de montagem. Finalize usando esmalte para selar as bordas da lamínula. Após a montagem dos embriões de peixe-zebra, vários segmentos HEMI acima da extensão do saco de carvalho foram visualizados.

Esta figura mostra a expressão de NK X 6,1 na medula espinhal ventral do embrião de peixe-zebra. O mRNA NK X 6.1 é distribuído aproximadamente na metade ventral da medula espinhal 24 horas após a fertilização. Dentro do domínio progenitor, as células progenitoras são distinguíveis das células pós-mitóticas devido à presença da placa de assoalho, que é encontrada na parte medial da medula espinhal.

Visto com óptica DIC. As células individuais são claramente distinguíveis e um limite definido entre células que expressam e não expressam é evidente. A saída do ciclo celular progenitor é acompanhada por alterações na expressão gênica.

Esta imagem mostra a expressão do robo três em neurônios pós-mitóticos. A família de receptores robóticos são receptores de orientação axonal cuja expressão permite contagens precisas de neurônios pós-mitóticos. Observe que a placa de piso e a zona progenitora não são evidentes neste plano focal mais lateral.

A microscopia confocal foi usada para obter imagens de imunofluorescência znp one, que marca os axônios motores como mostrado neste embrião montado lateralmente. Os neurônios motores saem da medula espinhal ventralmente 24 horas após a fertilização para inervar a musculatura em desenvolvimento circundante. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 30 minutos se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de preservar a integridade dos tecidos por meio de uma microdissecção cuidadosa. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar técnicas de microdissecção para remover a gema de embriões de peixe-zebra para montagem e visualização microscópica.