Recuperação de antígeno induzida por calor: um método eficaz para detectar e identificar tipos de células progenitoras durante a neurogênese do hipocampo adulto

O objetivo geral deste procedimento é realizar a recuperação de antígenos no tecido cerebral do hipocampo para visualizar melhor os tipos de células progenitoras que dão origem aos neurônios recém-nascidos. Isso é feito primeiro colhendo o cérebro perfundido de camundongos cortando seções coronais finas e montando essas seções em uma lâmina de vidro, projetada especificamente para aderir fortemente ao tecido. O segundo passo é ferver as lâminas com tecido e tratamento atópico de Kay e permitir tempo suficiente para o resfriamento.

Em seguida, core o tecido durante a noite com anticorpos primários. A etapa final é realizar a coloração secundária de anticorpos no tecido no dia seguinte por pelo menos duas horas. Em última análise, visualize os vários tipos de células pró-gênero nos vários estágios de desenvolvimento durante a neurogênese adulta do tecido hipocampal com lapso de tempo ou microscopia confocal.

Olá, meu nome é Hun Jo, pós-doutorado, membro do laboratório do Dr. Ian John e da Mayo Clinic. Nosso foco principal no John Lab é investigar o processo de outras neurogêneses em distúrbios neurológicos e psiquiátricos. Nosso objetivo final é traduzir com sucesso esse conhecimento em aplicação terapêutica, demonstrando que nosso procedimento de antigen retriever será Quam Hui e oi John de nosso laboratório.

A principal vantagem de nossa técnica sobre os métodos existentes de imuno-histoquímica é que ela permite a visualização efetiva de tipos de células distintas durante a neurogênese do hipocampo adulto. Esses tipos de células, incluindo as células-tronco neurais precursoras que, de outra forma, são difíceis de detectar, podem ser rotulados e visualizados com eficiência usando nosso método de recuperação de antígenos. Este método fornecerá informações sobre o desenvolvimento e a regulação dos neurônios recém-nascidos durante a neurogênese do hipocampo adulto.

Para os interessados no estudo de transtornos mentais e tratamento farmacológico, nossa recuperação de antígenos será útil na investigação do papel do desenvolvimento neuronal durante esta doença. Patogénese. Comece o procedimento colocando o cérebro de um camundongo perfundido em formaldeído a 4% de para-formaldeído em um tubo cônico de 10 mililitros durante a noite a quatro graus Celsius, ou por pelo menos 12 a 24 horas, mas não mais do que 36 horas para fixação completa. Após a fixação durante a noite, remova o PFA e deixe o cérebro no tubo cônico.

Em seguida, enxágue o cérebro com 30% de sacarose para remover qualquer PFA residual e descarte a sacarose. Em seguida, encha o tubo com sacarose a 30% novamente e mantenha-o a quatro graus Celsius até que o cérebro afunde no fundo do tubo. Depois, corte o hipocampo em seções cerebrais de 40 micrômetros em um micrótomo.

Conservar as secções na solução anticongelante até estarem prontas para a imuno-histoquímica. Em seguida, monte as fatias nas lâminas do microscópio que são projetadas especificamente para aderir fortemente ao tecido. Depois de montar o tecido, deixe as lâminas secarem por cerca de 10 minutos.

A secagem pode ser acelerada se as lâminas forem apoiadas contra uma superfície vertical em uma toalha de papel para garantir a remoção completa de produtos químicos anteriores. Quando as lâminas estiverem secas, lave-as com PB S3 vezes por cinco minutos de cada vez. Em seguida, deixe secar novamente.

Neste procedimento, prepare a solução para ebulição do tecido de acordo com a descrição no manuscrito anexo. Em seguida, ferva a solução por cinco minutos em um micro-ondas padrão na configuração padrão. Quando a fervura estiver completa, remova cuidadosamente o recipiente do microondas.

Depois disso, transfira as lâminas secas para a solução. Certifique-se de que o lado com as seções do hipocampo esteja totalmente exposto à solução. Se possível, coloque as lâminas em ângulo contra as paredes do recipiente e empilhe outras lâminas ao redor delas.

Em seguida, ferva a mistura com as lâminas por sete minutos no microondas nas configurações padrão. Enquanto isso, encha dois baldes de gelo até a metade com gelo. Quando a fervura estiver concluída, retire o recipiente do micro-ondas e coloque-o dentro de um dos baldes de gelo.

Despeje o resto do gelo do outro balde ao redor do recipiente e cubra-o completamente. Depois disso, deixe descansar por uma hora após uma hora. Remova as lâminas do recipiente.

Lave-os com tampão TBST três vezes por cinco minutos de cada vez. Em seguida, seque as lâminas no escuro por cinco a 10 minutos ou até que a lâmina esteja totalmente seca. Enquanto isso, prepare uma câmara com DDH dois O para coloração de anticorpos primários durante a noite.

Depois que as lâminas secarem, desenhe um contorno ao redor das seções de tecido usando uma caneta apelante de água. Este contorno atua como uma barreira para evitar que a mistura de anticorpos flua. Em seguida, prepare a mistura de anticorpos primários em T-B-S-T-T.

Coloque as lâminas secas no palco da câmara de coloração. Adicione 500 microlitros do anticorpo primário lentamente para cobrir toda a superfície. Em seguida, cubra a câmara de coloração para bloquear a luz externa e mantenha-a durante a noite em temperatura ambiente no dia seguinte, lave as lâminas três vezes por cinco minutos de cada vez com tampão TBST.

Depois disso, seque-os no escuro. Agora prepare a mistura de anticorpos secundários em T-B-S-T-T. Em seguida, coloque as lâminas secas na câmara de coloração.

Adicione 500 microlitros do anticorpo secundário. Cubra lentamente a câmara de coloração e mantenha-a longe da luz externa por pelo menos duas horas em temperatura ambiente após a conclusão da coloração secundária, lave as lâminas três vezes por cinco minutos de cada vez com tampão TBST, seque as lâminas no escuro após a secagem. Adicione solução de montagem às corrediças.

Cubra-os com lamínulas cuidadosamente para evitar a introdução de bolhas. Em seguida, mantenha as lâminas no escuro por pelo menos duas horas antes da análise subsequente e da realização de lapso de tempo ou análise de conversa no tecido corado. A neurogênese do hipocampo adulto é representada na zona subgranular do giro denteado.

Uma célula-tronco glial radial ativada como a célula-tronco tipo um passa por fases distintas à medida que se diferencia, amadurece e se integra funcionalmente com uma morfologia elaborada no circuito neuronal. Cada uma das fases e os respectivos tipos de células podem ser identificados com base na expressão de uma combinação de marcadores. O MCM dois é um marcador de proliferação que é expresso em todos os tipos de células progenitoras mitóticas, enquanto a neína é expressa entre células-tronco gliais radiais e não radiais.

À medida que os progenitores do tipo dois A se diferenciam, a expressão aninhada é primeiro desligada. Anti TBR dois aumentos de expressão no progenitor pós-mitótico MCM dois a expressão é perdida, enquanto a expressão de DCX e NEWAN dita a migração e maturação em um neurônio funcional. Esta é uma imagem confocal representativa de MCM roxo, dois neston verde e coloração dappy vermelha.

As imagens ampliadas nas caixas mostram um progenitor radial semelhante a GL expressando neston MCM dois e dpi. Aqui está uma imagem confocal representativa de MCM azul dois vermelhos, TBR dois DCX verdes e dpi cinza. A coloração da característica de um tipo de célula progenitora Tipo dois B é mostrada nas imagens ampliadas nas caixas que expressam MCM dois, TBR 2D, c, X e dpi.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar três coisas. Um, utilize tecido bem perfundido e fixado com a espessura coronal direita. Dois, montar o tecido plano nas lâminas e evitar qualquer dano ao fazê-lo.

E, finalmente, três, permitindo tempo suficiente para fervura e resfriamento subsequente durante a recuperação do antígeno. Após este procedimento, outros métodos, como reconstrução de tecido confocal e experimentos de comportamento, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre como os neurônios recém-nascidos podem se integrar ao circuito do hipocampo e contribuir para a função cognitiva. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar o antigen retriever em seu tecido hipocampal para visualizar com maior eficácia, os tipos de células representativas que dão origem a novos neurônios durante outras neuroses hipocampais.