Procedimentos para identificar Infecciosas príons após a passagem através do sistema digestivo de uma espécie de aves

O objetivo geral deste procedimento é documentar a passagem de material infeccioso PreOn através do sistema digestivo de American Crows. Isso é feito primeiro medindo corvos com material PreOn infeccioso. O segundo passo é coletar as fezes do corvo por quatro horas após a gavagem e prepará-las para injeção em camundongos.

Em seguida, os camundongos são inoculados intraperitoneal com um mililitro de homogeneizado fecal de corvo. A etapa final é monitorar os camundongos diariamente até que eles expressem sinais clínicos de raspagem de camundongos. Em última análise, a análise de western blot é usada para confirmar a presença de PreOn infeccioso no modelo de camundongo e verificar a transmissão da doença.

A ideia de que os corvos poderiam transportar. CWD veio até nós em um dia de inverno, quando depois de dirigir para uma instalação de alces em cativeiro, onde estávamos fazendo algumas pesquisas e vendo alces atropelados sendo alimentados por corvos, e mais tarde naquele dia, corvos saindo do céu do nada, pousando nesses cochos de alimentação, alimentando-se ao lado dos alces, defecando no grão que os alces estavam consumindo, além da observação da literatura de que muitos dos corvos naquele verão em todo o Colorado, Wyoming inverno em uma área concentrada no Novo México, acontece que essa área no Novo México é onde alguns CABD surgiram e fica a cem milhas a centenas de quilômetros de distância do epicentro da doença do crack. Portanto, essas duas observações nos fizeram pensar que potencialmente os corvos poderiam desempenhar um papel no transporte de CWD pela paisagem.

Uma demonstração visual dessas técnicas é crítica, pois técnicas incorretas de gavagem intraperitoneal e oral podem resultar na morte dos animais do estudo. Para começar, adicione quatro gotas de corante azul a um ovo mexido e misture bem. Em seguida, desenhe cinco mililitros da mistura de corante e ovo em uma agulha de gavagem de duas polegadas com uma pessoa segurando suavemente o corvo.

Abra o bico do corvo o suficiente para ver sua garganta e insira cuidadosamente a agulha de gavagem em seu esôfago. Se notar alguma alteração na respiração, remova a seringa e tente novamente, pois ela pode ter sido colocada na traqueia. Quando tiver certeza de que a agulha de gavagem está no esôfago, expresse lentamente o conteúdo da seringa.

Verifique o corvo a cada 30 minutos até que as fezes manchadas de azul-esverdeado não estejam mais sendo excretadas. Os corvos de teste levaram aproximadamente quatro horas para parar de excretar fezes tingidas de azul. Em seguida, adicione uma parte de cérebro de camundongo C 57 preto de seis não infectados a quatro partes de PBS estéril e algumas contas de vidro em um liquidificador de bala.

O homogeneizador homogeneiza a amostra por um a cinco minutos até que a consistência lisa seja alcançada. Repita o processo usando a cepa R ML Chandler infectada com C 57 em estado terminal. Em seguida, centrifugue o homogêneo a 3000 vezes G por um minuto.

Para remover o material particulado maior. Em seguida, remova o sobrenadante e dilua-o com um volume igual de XPBS estéril para gerar um peso de 10% por volume de matéria cerebral. Em PBS, armazene as amostras a 80 graus Celsius negativos até que sejam necessárias 17 horas antes da gavagem.

Remova a comida, mas não a água dos currais. Aloque aleatoriamente os corvos em grupos de tratamento e gasnage oralmente cada corvo com cinco mililitros de homogeneizado de cérebro de camundongo recém-descongelado, normal ou infectado usando uma agulha de gavagem de duas polegadas. Em seguida, transfira os corvos para gaiolas individuais.

Colete e agrupe todas as fezes dentro de cada gaiola quatro horas após a gavagem. Em seguida, homogeneizar as fezes acumuladas para cada corvo em um homogeneizador de bala azul com contas de vidro até obter uma textura uniforme. Em seguida, pegue 500 microlitros da mistura e dilua de um a 20 com 9,5 mililitros de centrífuga PBS estéril, o homogeneizado fecal diluído por 15 minutos.

Adicionar 1 300 vezes G e transferir o sobrenadante para um tubo novo. Para minimizar a ameaça de uma infecção microbiana secundária, adicione uma unidade de penicilina e um micrograma de estreptomicina por mililitro de homogeneizado. Em seguida, sonicar as amostras em um ator de 3000 MP a uma potência de 70 por 30 segundos para romper a membrana de quaisquer micróbios restantes.

Primeiro, atribua aleatoriamente os ratos a um dos quatro grupos mostrados aqui. O grupo um receberá fezes de corvo infectadas. O grupo dois receberá fezes de corvo não infectadas.

O grupo três receberá cérebro de camundongo infectado e o grupo quatro receberá cérebro de camundongo normal. Em seguida, para os grupos MN um e dois, retire um mililitro das fezes de corvo positivas ou negativas raspadas. Homogeneizar com uma agulha de calibre 25 de acordo com o número do grupo do rato.

Em seguida, aperte o rato pelo dorsal do pescoço. Usando o polegar e o indicador e gire-o suavemente para expor o lado ventral. Eleve a extremidade posterior do mouse para que sua cabeça fique ligeiramente mais baixa.

Insira a agulha um centímetro através da pele, um centímetro lateral da linha média e um a dois centímetros anterior à articulação sacroilíaca. Em seguida, puxe ligeiramente para trás e injete o homogêneo lentamente na cavidade do corpo do camundongo. Em seguida, prepare o homogeneizado de cérebro de camundongo congelado com e sem fragmentação para injeção nos animais dos grupos três e quatro.

Diluindo primeiro as misturas de estoque de haws de um a 10 com PBS estéril. Em seguida, injete um mililitro do homogeneizado cerebral positivo raspado diluído em camundongos do grupo três e um mililitro do homogeneizado cerebral negativo raspado diluído nos camundongos. No grupo quatro.

Monitore os ratos diariamente até que eles expressem sinais clínicos de raspagem de camundongos. Os sinais clínicos podem incluir cifose, ataxia, cauda rígida, falta de higiene, emagrecimento e letargia. Marque meu diário para cada um dos seis sinais clínicos.

Quando os sinais visíveis são evidentes. Zero é igual a nenhum sinal visível. Um é igual a moderado e dois é igual a um nível grave de um sinal.

Eutanasiar camundongos quando o total de pontuações diárias para cada sinal atingir maior ou igual a oito por um dia maior ou igual a seis continuamente por três dias ou em 365 dias. Após a inoculação, colha os cérebros imediatamente após a eutanásia e armazene-os a 80 graus Celsius negativos. Em seguida, descarte adequadamente as carcaças para confirmar um diagnóstico fragmentado.

Descongele os cérebros de camundongos congelados e homogeneize-os individualmente em um homogeneizador de bala azul com contas de vidro até obter uma textura uniforme. Em seguida, prepare 125 microlitros de uma solução de digestão de proteinase K combinando 109,39 microlitros de PBS com 12,5 microlitros de EDTA 500 milimolar em pH oito e 3,1 microlitros de uma solução de proteinase K de 50 microgramas por mililitro. Em seguida, adicione três microlitros da solução de digestão a 17 microlitros do cérebro. Homogeneizar.

Incube as amostras a 45 graus Celsius em um bloco de calor agitado por 30 minutos. Quando a incubação terminar, inative a solução de digestão adicionando oito microlitros de tampão de carregamento de página SDS e incube as amostras a 95 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, carregue as amostras em uma página de 12% SDS.

Eletroforese em gel as proteínas e transfira o gel para uma membrana IMON PVDF Uma vez transferido, bloqueie a membrana PVDF com 5% de leite desnatado em PBS com 0,2% entre 20 e rocha por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, sonde a membrana com empréstimo 224 e anticorpo monoclonal IPRP conjugado à peroxidase de rabanete diluído de um a 20.000 em superbloco e rocha por uma hora em temperatura ambiente após a incubação. Enxágue a membrana por uma hora em PBS com 0,2%entre 20.

Visualize as proteínas incubando a membrana com substrato quimioluminescente por cinco minutos. Em seguida, a imagem da membrana em um sistema de documentação de gel G box. Os camundongos doentes foram identificados pela manifestação de sinais clínicos de raspagem em camundongos e a confirmação da doença foi completada por análise de sangue ocidental.

Cérebro de camundongo normal, homogêneo sem raspo, é mostrado aqui na esquerda, duas pistas com e sem o auxílio da protease K: Sem protease K, três curvas são vistas. No entanto, como a proteína normal é suscetível a proteinases, as curvas não são vistas na segunda faixa. A pista três mostra uma amostra de controle positivo raspado digerido por protease.

As proteases causam um deslocamento nas três bandas originais devido à perda dos terminais n e c das proteínas. Mas as proteínas infectadas não podem ser completamente digeridas como na amostra normal do cérebro. O cérebro digerido pela proteinase K de um camundongo inoculado com fezes de um corvo inoculado é mostrado à direita e confirma a presença de príons na amostra, pois as bandas não são digeridas.

Depois de assistir a este vídeo, você terá uma maior compreensão de como documentar a passagem de material infeccioso de príons pelo sistema digestivo dos corvos. Em seguida, verifique a infectividade com um bioensaio interperitoneal em camundongos.