Isolamento de Cortical Microglia com Imunofenótipo preservada e funcionalidades de murino Os recém-nascidos
30 de janeiro de 2014
Uma chave para o sucesso na investigação de biologia da microglia é a preservação do immunofunction microglial ex vivo durante o isolamento a partir de tecido do SNC. Isolando microglia através de resultados de agitação rotativos em culturas de células altamente puras e imuno avaliado pela imagem fluorescente, imunocitoquímica e ELISA após a ativação da microglia com o lipopolissacarídeo estímulos pró-inflamatória (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).
O objetivo geral deste procedimento é isolar a micróglia cortical de recém-nascidos murinos. Isso é realizado pela primeira dissecação de tecido cerebral cortical de recém-nascidos Muren. O segundo passo é cultivar culturas mistas de células gliais por 17 a 21 dias in vitro.
Em seguida, as microglias são isoladas dessas culturas gliais mistas. A etapa final é colocar células microgliais em placas de cultura de células para experimentação posterior. Em última análise, a microscopia de imunofluorescência e Eliza são usadas para mostrar que este protocolo de isolamento preserva o fenótipo e a funcionalidade do imuno microglial.
A demonstração visual deste método é crítica, pois o SEP envolvido na micromicrodissecção é difícil de realizar. A execução bem-sucedida deste procedimento requer velocidade e precisão. Ou seja, ser muito lento reduzirá o rendimento celular, enquanto a remoção incompleta das meninges contaminará a cultura glial e impedirá o crescimento glial.
Comece preparando a mídia completa da microglia referida como MCM a seguir. Prepare um frasco por filhote e incube-o por pelo menos uma hora. Esta etapa de equilíbrio é essencial para o sucesso.
Em seguida, prepare a alíquota e leve à geladeira. Todos os meios necessários alíquota de seis mililitros de MCM para cada filhote e aquecer em banho-maria a 37 graus Celsius antes da dissecação. Limpe a estação de trabalho de fluxo de ar horizontal e o microscópio de dissecção com etanol a 70%.
Em seguida, coloque as ferramentas cirúrgicas esterilizadas necessárias para o procedimento na área de trabalho. Prepare um prato estéril com meios de dissecção para capturar a cabeça e outro para dissecação. Dispense o meio picador em seu próprio prato para picar o tecido cerebral.
Após a decapitação e extração do cérebro, coloque o cérebro recém-isolado sob um microscópio de dissecação para visualizar as cortesias, certificando-se de manter o lado dorsal para cima e seco. Prenda o cérebro inserindo as pontas das pinças na interseção do mesencéfalo e do córtex. Uma vez no lugar, remova completamente as meninges corticais dorsais.
Em seguida, remova as meninges ventrais para maximizar a pureza e o rendimento da microglia. É essencial remover completamente todo o tecido meníngeo. Separe os córtices do restante do cérebro.
Certifique-se de remover quaisquer meninges corticais residuais que possam estar presentes no lado ventral ou medial dos córtices. Com o tecido meníngeo removido, coloque os córtices na bandeja de picar preparada anteriormente. Trabalhando em um gabinete de segurança biológica de classe dois, use uma tesoura para picar o tecido cerebral.
Transfira o tecido picado para um tubo cônico de 15 milímetros. Lave a tesoura e a forma de picar com um mililitro de meio picador cada para maximizar os rendimentos. Recolha e distribua estes enxaguantes para o tubo cónico de 15 mililitros que contém o tecido picado.
Deixe a suspensão de tecido intacta por um a dois minutos, permitindo que o tecido picado se deposite no fundo do tubo. Após esse tempo, remova e descarte cuidadosamente dois mililitros do sobrenadante, tomando cuidado para não romper o tecido picado sedimentado. Adicione três mililitros do MCM previamente aquecido ao tecido picado e, em seguida, triture o tecido com força.
Nenhum tecido sólido discernível deve permanecer quando o teste estiver completo. Adicione mais três mililitros de MCM usando a mesma ponta de pipeta para coletar a amostra triturada residual da ponta. Depois de coletado, centrifugue o tecido picado para peletar as células.
Quando terminar, devolva as células peletizadas ao gabinete de segurança biológica. Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante. Gentilmente resus.
Suspenda o pellet celular com dois mililitros de MCM quente e, em seguida, adicione a suspensão de resus celular ao frasco preparado anteriormente. Incube as células por 24 horas. Após 24 horas, bata suavemente o frasco contra a palma da mão para romper os detritos do tecido.
Verifique as células antes e depois de bater para garantir que os detritos sejam completamente removidos. Em seguida, substitua o meio por MCM novo e devolva o frasco à incubadora. Verifique as células diariamente para monitorar o crescimento e a contaminação.
Após aproximadamente 17 a 21 dias, as células microgliais estarão prontas para a colheita para determinar se as células estão prontas, examiná-las em um microscópio de contraste de fase invertida. Microglia está pronto para a colheita. Quando atingem aproximadamente 40% de fluência, aparecem como células esféricas pequenas e brilhantes crescendo como uma monocamada em cima de outras.
Para isolar, a micróglia bate vigorosamente o frasco contra a bancada do laboratório. Essa agitação ajuda a separar a microglia de outras células gliais devido às propriedades de baixa aderência da microglia. Selar as tampas dos frascos com paraforme e rodar as culturas gliais mistas utilizando um agitador rotativo não humidificado com temperatura controlada durante cinco horas.
Após este tempo, inspecione visualmente se a micróglia se levantou da superfície do frasco. Usando um microscópio de contraste de fase invertida, as microglias são células flutuantes esféricas brilhantes. Haverá uma camada residual de astrócitos e oligodendrócitos aderidos ao fundo do frasco.
Em seguida, colete o sobrenadante contendo a micróglia em um tubo de centrífuga cônico estéril e palato. Resus. Suspender o sedimento microglial em meio de crescimento microglial quente e determinar a concentração celular utilizando uma placa de hemocitómetro. As células em um formato de placa de 24 poços em plástico ou vidro estéril lamínulas 24 horas depois.
Substitua a mídia por MGM quente para remover células flutuantes e detritos. Esta etapa é crítica para a sobrevivência celular e para manter a microglia quiescente, as células da microglia estão prontas para experimentação imediatamente após esta etapa de realimentação para avaliar a pureza microglial. Culturas de células derivadas de microglia expressando endogenamente GFP foram coradas para o antígeno de macrófagos IBA um e contra-coradas com dapi.
Para visualizar o núcleo celular, mais de 95% das células exibiram colocalização de GFP IBA um e dpi. Depois de desafiar as células com LPS, a microglia adotou uma mudança morfológica acentuada de um pequeno fenótipo bi para uma forma semelhante a um amebóide. A coloração imunofitoquímica para P 65 evidencia que, em condições normais, o P 65 está difusamente localizado em todo o citoplasma.
Considerando que, após uma exposição de duas horas ao Pam P 65, a imunorreatividade mudou drasticamente a localização para o núcleo da célula para confirmar que a microglia isolada manteve sua funcionalidade imunoquímica bioquímica. A secreção da citocina pró-inflamatória TNF alfa foi determinada após exposição ao PAM ou LPS. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar a micróglia cortical do espelhamento de neonatos para obter os melhores resultados.
É importante manter a técnica estéril e remover completamente o tecido meníngeo da região cortical dissecada.
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Visão Geral
Este artigo descreve um procedimento para o isolamento de micróglias corticais de neonatos murinos, enfatizando a importância de preservar a imunofunção das micróglias durante o processo. O método de isolamento envolve a microdissecação do tecido cerebral, o cultivo de células gliais mistas e, posteriormente, o isolamento das micróglias para experimentação.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Imunologia
Antecedentes
- As micróglias desempenham um papel crucial no sistema nervoso central (SNC).
- Os métodos de isolamento podem afetar a funcionalidade das células microgliais.
- A preservação da imunofuncionalidade é essencial para resultados experimentais precisos.
- Estímulos pró-inflamatórios são utilizados para avaliar a ativação microglial.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo confiável para o isolamento de micróglias de neonatos murinos.
- Garantir que as micróglias isoladas mantenham seu imunofenótipo e funcionalidade.
- Facilitar experimentações futuras sobre a biologia das micróglias.
Métodos Utilizados
- Dissecação microcirúrgica de tecido cerebral cortical de neonatos murinos.
- Cultivo de células gliais mistas por 17 a 21 dias in vitro.
- Isolamento de micróglias a partir de culturas gliais mistas.
- Uso de microscopia de imunofluorescência e ELISA para avaliar a funcionalidade das micróglias.
Resultados Principais
- O protocolo de isolamento fornece culturas de micróglias altamente puras.
- As micróglias mantêm características imunofuncionais após o isolamento.
- A ativação com LPS e Pam 3 CSK 4 demonstra a funcionalidade preservada.
- A imagem fluorescente e a imunocitoquímica confirmam os resultados.
Conclusões
- O método de isolamento descrito é eficaz para obter micróglias funcionais.
- A preservação da imunofunção é fundamental para estudar a biologia das micróglias.
- Este protocolo pode ser aplicado a diversas configurações experimentais envolvendo micróglias.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para o Setor Industrial
O isolamento de micróglia funcional de neonatos murinos permite a redução de riscos mecanicistas na validação de alvos em neuroimunologia, preservando o imunofenótipo e a resposta a estímulos inflamatórios. Este modelo ex vivo sustenta a confiança preditiva no estágio inicial de descoberta, mantendo estados quiescentes e ativados relevantes para as vias de doenças do SNC. O método fornece um sistema relevante para doenças, permitindo a triagem de compostos imunomoduladores e a avaliação do engajamento de alvos em fluxos de trabalho pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de vias de ativação de micróglias por meio de ensaios com desafio de LPS e Pam3CSK4.
- Valor Operacional: Gera micróglias corticais altamente puras com preservação da translocação nuclear de NF-κB p65 e da funcionalidade de secreção de TNF-α.
- Valor Preditivo: Apoia a verificação de hipóteses sobre alvos ao manter a fidelidade imunofenotípica desde estados quiescentes até estados pró-inflamatórios.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Fornece um sistema padronizado de monocamada de micróglias para triagem de compostos após 17–21 dias de maturação da cultura de gliócitos.
- Valor Operacional: Permite a quantificação da pureza das micróglias por meio da colocalização IBA-1/GFP (>95%) e leituras funcionais como a liberação de citocinas.
- Prontidão do Ensaio: Micróglias isoladas exibem respostas morfológicas e funcionais a estímulos, permitindo um perfil confiável de dose-resposta.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Translacional: Mantém a funcionalidade microglial ex vivo, apoiando a continuidade da descoberta à validação pré-clínica de alvos neuroinflamatórios.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Preserva a funcionalidade bioquímica (sinalização NF-κB, liberação de TNF-α) essencial para avaliar a modulação da via mediada por alvo.
- Relevância para Doenças: Modela estados de microglia quiescente e ativada, aplicáveis à pesquisa de doenças neurodegenerativas e neuroinflamatórias.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método de isolamento se insere na sequência de descobertas, desde a validação do alvo até a identificação de compostos promissores, ao fornecer uma plataforma reprodutível de micróglias para estudos de mecanismo de ação e triagem fenotípica em neuroimunologia.
- Biologia da Descoberta: Apoia a elucidação de vias por meio de ensaios de translocação de NF-κB e secreção de citocinas após desafio imunológico.
- Triagem: Permite a padronização de ensaios por meio de rendimento, pureza e resposta funcional consistentes de micróglias após isolamento com agitador rotativo.
- Análises: Gera variáveis dependentes quantitativas, incluindo níveis de secreção de TNF-α e localização nuclear de p65, para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta a função de micróglias ex vivo à relevância in vivo por meio da preservação do imunofenótipo e da cinética de ativação.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho reutilizável de isolamento de micróglias aplicável a múltiplas campanhas de validação de alvos no SNC.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da preservação do imunofenótipo microglial e da funcionalidade responsiva a estímulos.
- Valor Operacional: Isolamento padronizado por agitação mecânica produz culturas microgliais reprodutíveis com pureza superior a 95% e integridade funcional.
- Valor Estratégico: Reduz a ambiguidade mecanicista em triagens de neuroimunologia ao manter o comportamento microglial ex vivo indicativo de estados in vivo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos imunomoduladores com base no envolvimento comprovado com alvos em ensaios funcionais com microglia.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em dissecação de tecidos murinos neonatais e técnicas estéreis de cultivo de células gliais.
- Depende de agitador rotativo com controle de temperatura e microscopia de contraste de fase invertida para o isolamento e verificação de micróglias.
- Necessita padronização da remoção das meninges e da duração do cultivo (17–21 dias) entre as equipes, para garantir o rendimento e a pureza das micróglias.
- A adaptação a outros sistemas modelo pode exigir otimização do tempo de dissociação e das propriedades de adesão das micróglias.
- Limitação prática: o rendimento de micróglias depende da remoção completa do tecido meníngeo para evitar contaminação do cultivo glial.
