Identificação de modificações pós-translacionais de Complexos de proteína vegetal

O objetivo geral deste procedimento é identificar modificações pós-traducionais de proteínas envolvidas em complexos de proteínas vegetais expressas primeiro de forma transitória ou estável na planta a proteína de tags de interesse. Em seguida, extraia as proteínas totais do tecido da planta e precipite imunologicamente a proteína de interesse. Em seguida, separe as proteínas imunoprecipitadas em um gel de acrilamida e extraia e digere as proteínas da banda de gel de interesse.

Agora envie as amostras de proteína para espectrometria de massa. Em última análise, os resultados da espectrometria de massa podem detectar mudanças dinâmicas em modificações pós-traducionais, como a fosforilação. Ao contrário de métodos alternativos, como a incubação in vitro de quinase com substrato, este método expressa proteínas em plantadeira.

Portanto, você não precisa saber qual quinase é responsável pela fosforilação. Esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia vegetal, como como os sinais são transduzidos em resposta ao estresse, mudanças ambientais ou reconhecimento de patógenos. Além da identificação de fosforilação, locais de complexos de proteínas de resistência ativada, este método pode ser amplamente aplicado a qualquer modificação pós-traducional de qualquer complexo de proteínas vegetais.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque não estão acostumados a trabalhar com grande quantidade de extrato e realizar mais etapas do protocolo em um único dia. Para expressão transitória, cultive as cepas de agrobacterium tohin até a fase estacionária. Colha as bactérias agrícolas por centrifugação a 3000 Gs por cinco minutos.

Ressuspenda os pellets e o tampão de infiltração. Buffer. Agora se infiltra. Plantas de NCOA hamana de quatro semanas com agrobactérias manualmente usando uma seringa sem agulha de um mililitro ou por vácuo com 0,02% de surfactante, dois a cinco dias após a infiltração.

Colha as folhas infiltradas, congele-as em nitrogênio líquido e armazene-as a 80 graus Celsius negativos. Em seguida, mói 20 gramas de tecido vegetal e nitrogênio líquido usando um almofariz e pilão a 80 mililitros de tampão frio C a 20 gramas. Misture bem e descongele no gelo.

Agora homogeneizar com três rajadas de 10 segundos cada em velocidade máxima. Filtrar o homogeneizado e centrifugar a 30 000 Gs durante 30 minutos a quatro graus Celsius. Enquanto isso, para 100 microlitros de matriz de afinidade adequada a 500 microlitros de tampão de bloqueio a frio D por cinco minutos a quatro graus Celsius e lavado três vezes com um mililitro de tampão frio D.Em seguida, remova o supernat do extrato da folha e passe-o por uma seringa de 0,45 micrômetro.

Filtre em um novo tubo no gelo. Alíquota do extrato bruto. Para um immunoblot.

Adicione cinco vórtices de buffer de carregamento de página XSDS e ferva as amostras para desnaturar. Adicione 50 microlitros da matriz de afinidade, suspensa no tampão D a cada tubo. Incubar com rotação suave por duas horas a quatro graus Celsius, centrifugar para pellets a matriz de afinidade.

Em seguida, pegue uma alíquota do extrato não ligado para uma mancha imunológica. Descarte o restante do sano, deixando aproximadamente 500 microlitros no fundo do tubo. Ressuspenda a solução de pasta com uma ponta de furo largo.

Agrupe a solução de lama mista de ambos os tubos em um único tubo de 1,5 mililitro. Pulsar três vezes por cinco segundos usando uma centrífuga de bancada para precipitar a matriz de afinidade e remover o supernat após três a cinco lavagens com um mililitro de tampão frio D.Remova o excesso de tampão D com uma seringa, a agulha elui com 200 microlitros do tampão de eluição apropriado sob agitação constante. Puxe os três EITs em um único tubo.

Em seguida, concentre as proteínas usando 30 microlitros de vórtice de resina de absorção. Vamos ficar por cinco minutos e precipitar a resina, descartar o supernat. Adicione 50 microlitros de um buffer de carregamento de página XSDS à matriz de afinidade precipitada ou vórtice de resina de absorção e ferva por 10 minutos a 80 a 100 graus Celsius em uma centrífuga de bloco de calor.

A matriz de afinidade fervida é resina por dois minutos a 10.000. Alíquota GS cinco microlitros do supernat para imunobloqueio e executado com outras frações em uma página SDS de 10 centímetros de comprimento. Gel para separação e identificação de proteínas fosforiladas por espectrometria de massas.

Coloque os 45 microlitros restantes em uma mancha de gel de página SDS. O gel de página SDS com azul brilhante de kamasi coloidal. Em seguida, detenha o gel com lavagem abundante e água, de preferência durante a noite.

Agora, com um bisturi limpo, retire a faixa de interesse do gel, corte a fatia de gel em cubos de dois a quatro milímetros e transfira a amostra para um tubo. Lave as peças de gel com 50% de aceto nitrilo e 50 milimolares de bicarbonato de amônio até a mancha. Em seguida, pipetar a solução.

Tomando cuidado para não remover pedaços de gel. Desidrate a amostra com 100% de aceto nitrilo por cinco minutos e remova o líquido livre. Em seguida, para reduzir as ligações de proteína di sulfeto a 10 DTT milimolar e incubar por 30 a 45 minutos a 56 graus Celsius com agitação, remova o líquido livre agora para alquilar os resíduos de cisteína.

Adicione 55 milimolares de cloro acetamida por 20 a 30 minutos em temperatura ambiente no escuro. Remova o líquido livre e lave os pedaços de gel duas vezes com 50% de aceto nitrilo por 10 minutos. Remova o líquido livre.

Agora desidrate os pedaços de gel com 100% de aceto nitrilo por cinco minutos e remova o líquido livre para o Triptych Digest. A 40 microlitros de solução de trabalho de tripsina, deixe os pedaços de gel reidratarem por 10 minutos com tampão de digestão suficiente para cobrir os pedaços de gel. Incube a 37 graus Celsius durante a noite para interromper a digestão e extraia os peptídeos dos pedaços de gel a 5% de ácido fórmico por cinco a 10 minutos.

Em seguida, transfira o supernat para um novo tubo, seque os peptídeos por liofilização ou um concentrador a vácuo e armazene as amostras a menos 20 graus Celsius. Este experimento purifica o complexo P-R-F-P-T-O quinase de nacoa hamana, Um transgênico NACOA hamana expressando 35 SPTO foi transitoriamente transformado com 35 SPRF flag, e o complexo foi imuno precipitado com Anti-Flag M dois aros. Os immuno blots ilustram a imunoprecipitação eficiente da proteína PRF alvo, tanto a PTO quanto a proteína efetora interagente copurificada com PRF, conforme indicado pela detecção de anticorpos e análise de espectrometria de massa.

Aqui, a estratégia era atingir a proteína PTO com Anti-Flag. A estratégia foi alterada. A fim de identificar locais de fosforilação da PTO.

A quantidade total de proteína PTO compreendendo o complexo PRF e a forma livre foi imunoprecipitada com Anti-Flag M two aros e submetida ao fracionamento de página SDS, digestão tríptica ingel e análise espectrométrica de massa resultou em peptídeos PTO abrangendo aproximadamente 80% de sua sequência. Curiosamente, um conjunto de locais de fosforilação únicos para peptídeos PTO foi identificado. Observe que os locais de fosforilação dupla foram identificados apenas na presença de qualquer proteína efetora.

É importante obter quantidades suficientes de proteína vegetal para identificar componentes de um complexo proteico e também detectar a modificação pós-traducional de uma proteína de interesse. Lembre-se de que modificações de mapeamento como a fosforilação requerem uma quantidade razoável de proteína da espectrometria de massa, portanto, pelo menos uma banda fraca deve ser evidente em seu gel após este procedimento. Outros métodos, como I, a identificação de componentes complexos podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como como a ativação do complexo imune leva à imunidade funcional.

Não se esqueça de que trabalhar com tampões orgânicos, bactérias e BBLs de barbear pode ser extremamente perigoso, portanto, tome precauções como usar luvas e casacos de colo.