Um protocolo para hepatite C Analisando replicação de vírus

O objetivo geral deste procedimento é investigar várias etapas do ciclo de replicação do vírus da hepatite C. Isso é realizado primeiramente gerando transcritos de RNA genômico do VHC a partir de construtos de plasmídeos do VHC linearizados. O segundo passo é transfectar as células com o RNA do VHC. Em seguida, as células são semeadas para diferentes pontos temporais e ensaios. O passo final é coletar o sobrenadante do cultivo celular para medir o título viral e colher as células transfectadas para obtenção de proteína e RNA. Por fim, são realizadas a reação em cadeia da polimerase após transcrição reversa, o Western blot, o ensaio de imunofluorescência e a determinação do título do VHC, demonstrando um sistema robusto de cultura celular infecciosa pelo VHC.

A principal vantagem deste sistema de cultura celular de vírus da hepatite C infeccioso em comparação com o sistema de replicon de VHC é que permite investigar as etapas de entrada viral, montagem do virion e saída celular. Este protocolo pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da virologia da hepatite C, como a morfogênese do virion e a interação entre o patógeno e o hospedeiro. As implicações desta técnica estendem-se para o desenvolvimento de vacinas, pois permitem a caracterização de cepas virais atenuadas que podem ser avaliadas como candidatas potenciais a vacinas.

Embora este método possa fornecer informações sobre o vírus da hepatite C, ele também pode ser aplicado a outros vírus de RNA da família Flaviviridae. Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão o desafio de gerar RNA genômico de alta qualidade do HCV. O estudo do ciclo completo de replicação do HCV tornou-se viável em cultura celular após a descoberta de um isolado japonês do genótipo 2A do HCV associado à hepatite fulminante. A demonstração visual do ensaio virológico é fundamental, pois o ensaio exigirá expertise em técnicas moleculares e celulares.

Utilizando um vírus quimérico intra-genótipo 2A, F-N-X-H-C-V e F-N-X-H-C-V pol-null HCV para avaliação da replicação viral, linearize plasmídeos virais previamente gerados mediante digestão com a enzima de restrição XBA-um em um tubo de dois mililitros. Em seguida, trate os plasmídeos com nuclease de feijão-mungo para gerar extremidades rombas.

Purifique os plasmídeos digeridos por cromatografia de troca aniônica. Verifique a integridade do plasmídeo linearizado submetendo o DNA à eletroforese em gel de agarose. Em seguida, adicione o molde de DNA do plasmídeo linearizado a um tubo de 0,2 mililitros contendo os componentes da reação da RNA polimerase T-sete para sintetizar transcritos de RNA genômico do VHC.

Purifique o RNA recém-sintetizado tratado com DNase utilizando um kit de purificação de RNA. Em seguida, verifique a produção de RNA por eletroforese em gel de agarose. Após isso, quantifique o RNA por espectrofotometria.

Desprenda as células aderentes baseadas em Huh-7 utilizando tratamento com enzima tripsina e colete as células em um tubo cônico de 50 mililitros. Duas centrifugações subsequentes seguidas de ressuspendimento do pellet celular em meio com baixo teor de soro frio. Após repetir a centrifugação, ressuspenda as células em meio com baixo teor de soro na concentração de um vezes 10 à sétima células por mililitro.

Em seguida, misture um total de 10 microgramas de RNA viral transcrito com 400 microlitros de células re-suspensas em uma cubeta de eletroporação pré-resfriada de 0,4 centímetro. Introduza o RNA viral nas células utilizando eletroporação com 270 volts, 100 ohms e 950 microfarads. Ao final, re-suspenda as células eletroporadas em 10 mililitros de meio de crescimento completo com 15% de FBS. Neste ponto, plaque as células em frascos T25 com cerca de 1,2 vezes 10 à sexta células por frasco e em placas de 48 poços com uma vez 10 à quarta células por poço para os pontos temporais de 4, 48 e 96 horas. Substitua o meio entre quatro e oito horas pós-transfecção por meio de crescimento suplementado fresco com 10% de FBS para remover detritos de células mortas dos frascos e placas cultivados.

Utilizando uma pipeta serológica, colete os sobrenadantes do cultivo celular nos pontos temporais de 48 e 96 horas em um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, remova os detritos celulares das amostras coletadas por centrifugação a 15.000 rpm durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, armazene os sobrenadantes livres de células a menos 80 graus Celsius.

Lise as células para análise de proteínas e RNA por meio de western blot e PCR quantitativa com transcriptase reversa ou RT-qPCR nos pontos de tempo indicados. Transcreva reversamente um micrograma de RNA celular total utilizando a enzima transcriptase reversa e um iniciador específico para a fita sentido do VHC que se liga à região não traduzida do extremo cinco primo em um tubo de 0,2 mililitro. Também realize a transcrição reversa do F-N-X-H-C-V-R-N-A com número conhecido de cópias genômicas utilizando um iniciador da fita sentido do VHC. Utilizando um sistema de PCR em tempo real, realize a qPCR empregando 50 nanogramas do cDNA transcrito resultante, com emprego de iniciadores específicos para o VHC e corante verde intercalante de DNA contido na mistura super qPCR. Utilize as seguintes condições ao executar a qPCR para determinar o número de cópias do R-N-A do V-H-C. Após a qPCR, resolva o lisado celular proveniente da transfeção com RNA viral em 96 horas pós-transfeção utilizando eletroforese SDS-PAGE. Em seguida, transfira as proteínas resolvidas no gel para uma membrana de difluoreto de polivinilideno pelo método trans-blot turbo. Bloqueie a membrana utilizando uma solução bloqueadora contendo leite desnatado a 5% e tween-20 a 0,2% em PBS e coloque em um recipiente.

Incube a membrana com o anticorpo primário monoclonal de camundongo NS3 em uma diluição de um para 1000 e beta-actina em uma diluição de um para 5.000, em uma câmara fria a quatro graus Celsius. Após a incubação, adicione imunoglobulina-G de cabra anti-camundongo conjugada à peroxidase de rábano-picante em uma diluição de um para 5.000 e detecte por quimioluminescência.

Neste momento, fixe as células transfectadas com H-C-V-R-N-A usando metanol por 30 minutos a 20 graus negativos Celsius para o ensaio de imunofluorescência. Ao finalizar, lave as células com PBS três vezes. Após o bloqueio com tampão de bloqueio para ensaio de imunofluorescência, use o anticorpo primário coelho policlonal anti-NS5A e o anticorpo primário monoclonal de camundongo anti-DSRNA J2 na diluição de 1:200 e incube por cinco horas até a noite em câmara fria a quatro graus Celsius. Após a incubação, lave as células com PBS três vezes após a aplicação do anticorpo primário. Em seguida, adicione o anticorpo secundário policlonal de cabra anti-imunoglobulina-G 488 e o anticorpo secundário policlonal de cabra anti-imunoglobulina de camundongo 594 na diluição de 1:1000 e incube por uma hora à temperatura ambiente em um agitador de bancada. Após lavar as células com PBS três vezes, contra-estaine os núcleos usando corante Hoechst e visualize utilizando um microscópio de fluorescência.

Plaque em seguida células Huh7.5.1 ingênuas na densidade de aproximadamente três vezes 10 elevado a três células por poço, utilizando uma placa de 96 poços. No dia seguinte, realize uma diluição seriada decimal do sobrenadante de cultura livre de células, colhido de células transfectadas com R-N-A do V-H-C, usando meio de crescimento, e inocule em triplicata sobre células Huh7.5.1. Fixe as células 72 horas após a infecção utilizando metanol por 30 minutos a 20 graus Celsius negativos. Após remover as células do congelador, realize a coloração imunofluorescente para a proteína NS5A do V-H-C nas condições previamente descritas. Utilizando um microscópio fluorescente, conte os focos celulares positivos para NS5A no poço com a maior diluição viral e calcule o número médio de unidades formadoras de foco por mililitro.

A qualidade do plasmídeo linearizado do VHC foi avaliada por eletroforese em gel. O DNA do VHC foi submetido à transcrição reversa in vitro mediada pela RNA polimerase T7, o que gerou um único produto de RNA com 9,6 quilobases. Os resultados de RT-qPCR indicaram que o vírus selvagem replicou o genoma de forma eficiente. O tipo selvagem exibiu um nível de replicação do genoma de um a três logaritmos mais alto em comparação com o vírus pol-nulo.

O vírus selvagem produziu a proteína NS3 envolvida na clivagem de proteínas virais e na replicação do genoma. O vírus selvagem também expressou a proteína NS5A, e a proteína NS5A e o RNA de dupla fita co-localizaram-se no citoplasma celular de células transfectadas com o tipo selvagem, sugerindo replicação viral ativa. Medições do título viral indicaram que o vírus selvagem é infeccioso e produz mais de 10.000 unidades formadoras de focos por mililitro de partículas infecciosas. Seis horas após a transfeção, tanto o vírus selvagem quanto o vírus pol-nulo apresentaram atividades semelhantes de luciferase, indicando um nível semelhante de entrada de RNA transfectado traduzido. No entanto, 48 e 96 horas após a transfeção, o vírus selvagem exibiu níveis aumentados de replicação do genoma em comparação com o vírus pol-nulo. O vírus selvagem também produziu a proteína viral NS3. O vírus pol-nulo apresentou atividade de luciferase em nível basal, enquanto o vírus selvagem apresentou um nível de replicação duas a três vezes maior em escala logarítmica em comparação com o vírus repórter pol-nulo. Uma vez dominados, os ensaios virológicos para hepatite C podem ser realizados em duas semanas, se forem executados corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante utilizar células robustas e transcritos de RNA genômico de HCV de alta qualidade. Após este procedimento, cepas caracterizadas de HCV podem ser testadas em sistemas de modelos animais para investigar a aptidão in vivo e as interações entre o hospedeiro e o patógeno.

O desenvolvimento de um sistema de cultura celular infeccioso para o HCV abriu caminho para que pesquisadores explorassem os passos da morfogênese do virion e da saída viral no ciclo de replicação do HCV. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar diversos ensaios virológicos para caracterizar diferentes estágios do ciclo de replicação do vírus da hepatite C. Não se esqueça de que trabalhar com o vírus da hepatite C pode ser extremamente perigoso e que precauções de segurança, como o uso de equipamentos de proteção individual apropriados, devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.