Cromatográfica em camada delgada (TLC) Separações e Bioensaios de extratos de plantas para identificar compostos antimicrobianos

O objetivo geral deste procedimento é identificar metabólitos vegetais que são antimicrobianos para bactérias anaeróbicas. Isso é feito separando primeiro um extrato vegetal por cromatografia em camada fina ou TLC. Em seguida, o cromatograma é cortado em zonas que compreendem um ou mais compostos.

As zonas são então colocadas em ágar inoculado com bactérias anaeróbicas e incubadas. Após a incubação, as zonas são removidas e as placas são coradas para identificar compostos que inibem o crescimento bacteriano. Os dados resultantes revelam a presença ou ausência de metabólitos antimicrobianos vegetais.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da nutrição de ruminantes, como quais são os efeitos dos metabólitos secundários das plantas na utilização de nutrientes por microrganismos específicos. Embora este método revele compostos vegetais que são inibidores das bactérias ruminas. Também pode ser aplicado para revelar compostos inibidores de outras bactérias ou fungos.

Neste protocolo, compostos fenólicos de trevo vermelho serão utilizados para demonstrar a identificação de compostos antimicrobianos por biografia de contato. Comece limpando a cromatografia em camada fina ou as placas TLC que trabalham em uma capela de exaustão. Prepare solvente de limpeza suficiente para cobrir o fundo da câmara de revelação de TLC, bem como a borda inferior da placa A TLC.

Quando colocado dentro da câmara aqui, o metanol de acetato de etila dois para um é preparado. Em seguida, usando luvas e trabalhando em um exaustor. Use uma tesoura para cortar placas de sílica flexíveis com suporte de alumínio ou plástico para caber na câmara de revelação.

Insira as placas na câmara com os topos encostados nas paredes da câmara. As placas não devem se tocar. Cubra a câmara e deixe o solvente subir pelas placas por ação capilar.

Quando o solvente atingir o topo das placas, retirá-las da câmara e dispô-las em posição permanente na hotte até que o solvente tenha evaporado. Quando as placas estiverem secas, verifique se as impurezas migraram para perto do topo das placas TLC. Eles aparecerão como uma faixa amarela sob luz visível ou uma faixa fluorescente sob luz ultravioleta.

Se a maior parte da placa ainda tiver uma coloração amarelada, repita o processo de limpeza na mesma câmara TLC usando o mesmo solvente. Depois de remover as placas de TLC da câmara, descarte o solvente. Deixar evaporar completamente o solvente residual antes de utilizar a câmara para a parte seguinte do protocolo.

Em seguida, para remover a umidade residual que pode afetar a migração de compostos na sílica, apoie as placas na vertical em um forno de secagem a 100 graus Celsius por 10 a 15 minutos para uma placa de 20 por 20 centímetros e cinco minutos para placas de sete por 10 centímetros. Quando as placas estiverem secas, deixe-as esfriar até a temperatura ambiente antes de carregá-las com extratos. Para preparar as câmaras para a separação do extrato, use uma tesoura para cortar um pedaço de papel de filtro ligeiramente abaixo da altura da câmara e cerca de metade do perímetro da câmara de largura.

Este papel funcionará como um pavio para aspirar solventes pela parede da câmara e saturar a câmara com papéis solventes, melhorando assim a reprodutibilidade das separações Em uma capela de exaustão, misture os solventes aqui. Os solventes utilizados são acetato de etila, metanol, quatro a um volume por volume. Despeje a mistura de solventes na câmara e cubra.

Use um lápis para marcar levemente a origem em um ponto da placa TLC que ficará acima da superfície do solvente revelador na câmara. Se o absorvente da placa TLC for macio e facilmente danificado, faça marcas nas bordas conforme mostrado aqui. Em seguida, dissolva os extratos em solvente orgânico suficiente para ter uma solução concentrada em vez de uma suspensão turva.

Aqui, o solvente usado é o metanol. O uso de micropipetas capilares ou uma seringa de microlitro carrega padrões e amostras como bandas estreitas, deixando uma borda de um centímetro nas laterais da placa, deixe as bandas secarem, ventilar a placa ou carregá-la em uma capela de exaustão ajuda a secar as bandas mais rapidamente. Depois que as bandas secarem, carregue as amostras novamente no mesmo local ou sobre o local.

Se for necessária uma concentração maior de amostra na placa, repita conforme necessário na câmara TLC. Certifique-se de que todo o pavio ficou saturado com solvente. Em seguida, com uma pinça ou pinça, coloque as placas dentro da câmara TLC.

As placas não devem tocar no pavio. Cobrir a câmara e deixar que as placas se desenvolvam antes de a frente do solvente atingir o topo da placa. Remova as placas do tanque de TLC e marque a altura da frente do solvente com um lápis.

Deixe o prato secar. Em uma capela de exaustão, desenvolva quaisquer placas TLC restantes na mesma câmara TLC, que geralmente pode ser usada por um dia inteiro se mantida fechada. Se a quantidade de solvente na câmara diminuir visivelmente, faça mais mistura de solvente depois que as placas estiverem secas.

Visualize as bandas sob luz visível ou UV. Uma câmara de visualização com uma lâmpada UV portátil é conveniente, especialmente se a lâmpada puder detectar compostos em UV de ondas curtas de 254 nanômetros e UV de ondas longas de 365 nanômetros. Use um lápis para delinear as faixas usando um sistema de documentação fotográfica em gel equipado com luzes aéreas, UV e/ou visíveis para obter imagens das placas.

Finalmente, para auxiliar na caracterização das bandas, calcule o fator de retenção ou os valores de RF medindo primeiro a distância percorrida pelo composto, depois medindo a distância percorrida pelo solvente e dividindo o primeiro pela escada. Uma vez que os locais da banda tenham sido marcados, as placas podem ser armazenadas para mais tarde. Utilização no bioensaio.

Embrulhe os pratos em plástico e cubra-os com papel alumínio. Armazene as placas a menos 20 graus Celsius. O tempo máximo de armazenamento depende da estabilidade do composto porque a sílica não é neutra.

Alguns compostos podem se degradar enquanto estiverem na placa de TLC. Em preparação para o ensaio de biografia de contato, prepare e inocule bactérias produtoras de hiper amônia ou meio HAB sob condições anaeróbicas. A cultura usada neste caso é a cepa ocular Clostridium stickland sr.

Aumente a cultura para a fase exponencial ou estacionária a 39 graus Celsius. Use técnicas anaeróbicas estéreis ao trabalhar com microrganismos anaeróbicos. Prepare o peso de 75% do ponto zero por volume.

Ágar no mesmo meio usado para cultivar a bactéria depois que a temperatura do ágar diminuiu para menos de 60 graus Celsius. Inocule o ágar fundido com 1% de volume por volume da cultura e misture delicadamente, coloque-o imediatamente em uma câmara anaeróbica e despeje em placas de Petri de plástico de 15 por 100 milímetros com uma tesoura. Corte a placa TLC em zonas contendo a faixa ou faixas de interesse.

Usando um sharpie, marcou a parte de trás das placas. Coloque uma tira de TLC não utilizada na placa de ágar como controle. Em seguida, coloque as faixas voltadas para baixo em placas de ágar.

Incubar as placas com o lado ágar voltado para baixo na câmara anaeróbica. Incubadora por 24 horas a 39 graus Celsius com pinça. Remova as bandas de TLC das placas de ágar enquanto elas estiverem na câmara anaeróbica.

Adicione tetra oleum red gota a gota nas superfícies das placas de ágar. Deixe a cor se desenvolver por pelo menos 20 minutos. Quando a placa de controle ficar completamente vermelha, remova as placas da câmara anaeróbica.

Clostridium stick Landi é uma bactéria anaeróbica, por isso começará a perder a viabilidade imediatamente após a remoção da câmara anaeróbica, mas a cor é estável por mais de 24 horas. Usando uma câmera digital, fotografe as placas sob luz visível em um fundo que forneça contraste suficiente. Uma cor vermelha brilhante será observada quando as células vivas forem coradas.

As células mortas não mancham. Sílica representativa, separações TLC de extratos de trevo vermelho contendo compostos fenólicos são mostradas aqui. A separação em acetato de etila hexano nove a um acima de 8,5 centímetros resultou em cinco bandas, uma completamente resolvida desde a origem.

Os padrões carregados foram Formin, Bio, Canon A e Genine. Quatro bandas desta placa foram aplicadas a culturas com Clostridium stick Landi, uma bactéria produtora de hiper amônia ruminal por 24 horas e corada com vermelho tetra oleum, conforme descrito aqui. A incubação com a banda um Bio Canon A e parte da banda dois quatro Monon nein em ágar semeado por bactérias resultou em uma zona de inibição bem definida.

No entanto, a incubação do restante da banda dois, juntamente com as bandas três e quatro, não inibiu o crescimento bacteriano. Esses resultados demonstraram que o bio Canon A era inibitório para ver o crescimento do olho de stickland, mas de um só Nein não era. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a técnica é flexível.

Podem ser utilizados outros microrganismos de ensaio, desde que sejam seleccionados meios adequados e sejam incluídos controlos para garantir que a química de separação e o método de detecção são compatíveis Seguindo este procedimento. Outras técnicas, como cromatografia líquida de alta eficiência e espectrometria de massa, podem ser usadas para ajudar a caracterizar os compostos antimicrobianos identificados em um bioensaio.