Isolamento de ARN a partir de pequenas não-codificante de Soro Humano

O objetivo geral deste procedimento é isolar RNA de alta qualidade de amostras de soro. Usando nossa versão otimizada do protocolo RTLS comum do MRC, tente o reagente. Isso é feito diluindo primeiro o soro em uma proporção de um para cinco com água livre de nuclease para diminuir a contaminação por proteínas.

O segundo passo é introduzir dois tubos de bloqueio de fase de mililitro para a primeira etapa de centrifugação. Isso retém a maioria dos contaminantes, como fenol e proteínas na fase orgânica. Em seguida, a terceira e última etapa de otimização é a centrifugação instantânea a 12.000 queijos, que remove qualquer contaminação residual do pellet de RNA antes das lavagens com etanol.

A etapa final é agrupar duas preparações de RNA modificadas do mesmo paciente se for necessário um rendimento total de RNA mais alto. Em última análise, usando este método modificado, que Solubiliza o soro em água livre de nuclease, emprega um tubo de bloqueio de fase para reter os principais contaminantes e introduz um flash spin. Mostramos que é possível maximizar a recuperação de pequenos RNAs sem revestimento de um isolamento de RNA do soro.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o protocolo padrão de isolamento de RNA de triol, é que, por meio de modificações simples, podemos maximizar o rendimento do RNA do soro. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque pequenos RNAs são encontrados em baixas quantidades no soro. O método otimizado e a visualização dessas etapas melhorarão a recuperação desses RNAs e guiarão os novatos para uma ponta de isolamento bem-sucedida.

Para começar a descongelar a amostra de soro congelada previamente preparada no gelo, transfira 400 microlitros do soro recém-descongelado para um tubo de microcentrífuga rotulado. Em seguida, dilua o soro com 100 microlitros de água livre de R nase e adicione 50 microlitros de proteinase K na concentração de um miligrama por mililitro. Em seguida, incube o soro diluído a 37 graus Celsius por 20 minutos para permitir a digestão adequada da proteína para garantir a solubilização completa a 1,5 mililitros de RTLS tri-reagente e 100 microlitros de quatro anolis promocionais.

Inverter brevemente o homogenato e efectuar pipetas repetitivas durante cinco segundos. Em seguida, transfira a mistura para um tubo de bloqueio de fase pesado de dois mililitros rotulado. Girar o homogeneizado a 12.000 GS por 20 minutos a quatro graus Celsius.

Em seguida, decantar cuidadosamente um mililitro da solução aquosa resultante em um tubo de baixa ligação de DNA fresco. O orgânico e a interface devem ser presos sob o gel branco do tubo de bloqueio de fase. Em seguida, adicione cinco microlitros de glicogênio e 500 microlitros de isopropanol a 100% à solução aquosa.

Misturar a solução por inversão e incubá-la durante a noite a 20 graus Celsius negativos. Após a incubação durante a noite, centrifugue a amostra por 20 minutos a 12.000 GS em uma centrífuga de quatro graus Celsius. Em seguida, descarte o sobrenadante claro e execute uma rotação rápida por dois minutos a 16.000 GS em uma centrífuga de quatro graus Celsius.

Usando uma pipeta, remova cuidadosamente a solução transparente ao redor do pellet. Em seguida, lave o pellet com um mililitro de etanol a 70% e centrifugue a amostra a 10.000 GS por 10 minutos. Para visualizar o pellet, incline o tubo na frente de um fundo escuro e retire a solução de lavagem.

Repita a lavagem. Intensifique. Suspendemos o pellet em 10 microlitros de água livre de RNA.

Certifique-se de que o pellet esteja completamente dissolvido aquecendo a amostra a 55 graus Celsius por cinco minutos. Durante esse tempo, misture a amostra com pipetagem repetida para um maior pool de rendimento total de RNA, duas preparações de RNA do mesmo paciente. Quantifique o RNA ressuspenso usando um UV vs.

Espectrofotômetro e avalie a qualidade do RNA usando um bioanalisador 2100. Em seguida, armazene as amostras de RNA agrupadas a menos 80 graus Celsius para uso em aplicações downstream. Os perfis fotométricos de espectros de RNA do soro humano demonstram o rendimento aprimorado de RNA devido à adição de várias etapas à abordagem tradicional de Chum Chomsky.

Um perfil UV típico de RNA isolado de soro humano contrasta com aqueles que utilizam etapas de otimização, incluindo a adição de glicogênio e spin extra, e cada uma dessas ferramentas combinadas, resultando em uma redução de contaminantes e um aumento do rendimento total de RNA. A pureza da amostra de RNA foi aumentada ainda mais com o uso de um gel de bloqueio de fase, que retém fenol e proteínas. Além disso, o aumento do volume de soro tem um impacto notável no rendimento do RNA.

Um traçado bioanalisador foi realizado para analisar melhor a qualidade da amostra. Um único pico em aproximadamente 21 nucleotídeos representa o perfil de matriz de frações de micro RNA e QPCR foram realizados após o procedimento. Este perfil de matriz de três cânceres de cabeça e pescoço e um S normal mostra a expressão de microRNAs, analisado usando agrupamento hierárquico e apresentado como um mapa de calor onde a regulação positiva e negativa dos microRNAs pode ser vista.

As curvas de amplificação de QPCR a seguir foram geradas para microRNAs específicos. Esses dados foram então usados para traçar os valores brutos de TC para o soro normal Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em qualquer número de pacientes que produzam RNA de alta qualidade no máximo de hoje, se for realizada corretamente após o procedimento. Outros métodos, como PCR quantitativo ou sequenciamento de próxima geração, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como descoberta e validação de biomarcadores.