Um Método de Esclarecimento Novo para Visualize biliar Degeneração Durante fígado metamorfose em lampreia de mar ( Petromyzon marinus)

O objetivo geral deste procedimento é esclarecer todo o fígado e a junção com o intestino para análises globais, estruturais e celulares da degeneração biliar. Em lampreia C metamórfica. Isso é feito primeiro fixando os tecidos na solução de monômero de hidrogel.

Em seguida, o hidrogel é polimerizado com os tecidos fixados. Em seguida, a membrana plasmática do tecido fixo é removida e o tecido torna-se transparente. Finalmente, a coloração imunofluorescente é realizada em última análise, a pele a laser e a microscopia confocal é usada para mostrar alterações estruturais e celulares globais durante a degeneração biliar em lamparia metamórfica.

Este método pode ajudar a responder questões-chave no campo biomédico, como os conectomas no sistema nervoso central e, no nosso caso, a degeneração biliar durante a metamorfose do ponto sérico. As implicações desta técnica se estendem para a terapia ou diagnóstico de vias biliares ou atresia humanas, pois esta rara doença congênita infantil compartilha características semelhantes com a degeneração ária durante a metamorfose do ponto sérico. Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando encontramos um artigo de notícias na natureza e apresentamos o vídeo on-line durante nossa reunião de laboratório demonstrando o procedimento será Ann Scott, uma estudante de pós-graduação de nosso laboratório Depois de fazer solução salina tamponada com fosfato e tampão fosfato ou pb, de acordo com o protocolo de texto.

Em uma capela de exaustão, prepare 400 mililitros de hidrogel combinando água destilada, 40% de acrilamida 2% bis acrilamida 10 XPBS, 16% de paraforma, aldeído, saponina e amônio por sulfato. Prepare um litro de solução de limpeza composta de 4% SDS e 0,2 molar de ácido bórico e faça 500 mililitros de glicerol a 80% para preparar o tecido na capela de exaustão. Eloqua 10 mililitros de solução de monômero de hidrogel em tubos de centrífuga de 15 mililitros.

Disseque a amostra de tecido e coloque o tecido em cada tubo de hidrogel fixado a quatro graus Celsius por dois dias. Após a incubação sob uma capela de exaustão, polimerizar o tecido fixo adicionando cinco microlitros de temid. Em seguida, misture bem e deixe as amostras incubarem em temperatura ambiente por duas a três horas.

Após a incubação, remova completamente o excesso de gel para limpar as amostras de tecido. Coloque cada um em 15 mililitros de solução de limpeza e incube a 50 graus Celsius e 70 RPMs por vários dias até que se tornem transparentes. Troque a solução de limpeza pelo menos uma vez por dia e remova o excesso de gel.

Transfira as amostras em 15 mililitros de 0,1 molar PB com 0,1% Triton X 100 a 37 graus Celsius e 70 RPMs durante a noite. Repita a incubação mais duas vezes com tampão novo. Agora que o tecido está limpo e livre de qualquer excesso de gel, mergulhe as amostras em anticorpo primário em PB tritton X 100 e incube a 37 graus Celsius e 70 RPMs por dois dias após a incubação, use 15 mililitros de PB com 0,1% tritton X 100 para lavar as amostras de tecido a 37 graus Celsius e 70 RPMs durante a noite.

Repita a lavagem três vezes após remover o tampão de lavagem final, adicione solução de anticorpo secundário fluorescente em PB com 0,1% Trix 100 e soro de bloqueio e incube no escuro a 37 graus Celsius e 70 RPMs por um dia. Depois de lavar as amostras três vezes em 10 mililitros de PB tritton X 100 a 37 graus Celsius e 70 RPMs durante a noite, faça três lavagens noturnas em PBS. Por fim, incube o tecido clarificado em 80% de glicerol coberto com papel alumínio durante a noite.

A imagem de microscopia confocal é então realizada com luz escura ou fraca, embora as luzes estejam acesas neste vídeo para fins de visualização. Vários eventos importantes de desenvolvimento ocorrem no sistema biliar HEPA durante a metamorfose da lâmpada, por exemplo, como mostrado aqui, o ducto biliar e a vesícula biliar sofrem apoptose e degeneram. Após o uso do método de clarificação modificado e coloração com marcador de células hepáticas citoqueratina 19 anti-antiapoptótica, BCL duas microscopias confocais de varredura a laser foram usadas para realizar a secção óptica através do fígado intacto.

A coloração revelou que o processo degenerativo ocorre nos estágios metamórficos de dois a quatro. Os painéis superiores são da extremidade anterior e os painéis inferiores são da extremidade posterior. Aqui é mostrada a árvore biliar e aqui estão as células apoptóticas de aparência dendrítica escura e os canalículos circundantes e as ferramentas de ducto no fígado.

Esta figura representa imagens tridimensionais reconstruídas a série Z confocal de três fígados entre os estágios metamórficos dois e três marcados com anticorpos contra citoqueratina 19 e BCL dois, a árvore biliar e as células apoptóticas de aparência dendrítica escura e os canalículos e ferramentas de ducto circundantes são marcados por setas brancas e pretas, respectivamente. Aqui é mostrada uma seção óptica confocal dos ductos biliares de uma amostra entre os estágios metamórficos dois e três com gotículas biliares no lúmen. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como esclarecer todo o tecido para análises de imagem adicionais.

Não se esqueça de que trabalhar com soluções de paraforme, aldeído e poliacrilamida pode ser extremamente perigoso, e precauções como usar luvas e usar a hotte devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.