Concentração Determinação Viral Através de placa Ensaios: Usando tradicionais e novos Sistemas de sobreposição

O objetivo geral deste procedimento é determinar a concentração viral por meio da quantificação de vírions infecciosos, contando placas discretas em cultura celular. Isso é realizado primeiramente cultivando células para formar uma monocamada confluente destinada à infecção. O segundo passo consiste em realizar diluições seriadas da amostra viral desconhecida a ser quantificada. Em seguida, as monocamadas confluentes são infectadas utilizando as diluições seriadas do estoque viral, seguido pela aplicação de uma camada sobreposta imobilizadora. O passo final é fixar e corar as placas após o tempo apropriado de incubação para o vírus em questão, a fim de contar as placas discretas. Em última análise, os ensaios de placa podem ser utilizados e modificados de diversas maneiras para determinar os títulos virais de uma amostra viral desconhecida.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a camada semissólida, é que a aplicação e remoção são muito mais simples tanto em aplicações de alto rendimento quanto nas tradicionais. Além disso, não é necessária a aquecimento dos reagentes. As implicações desta técnica estendem-se à pesquisa de muitos vírus líticos diferentes, pois o uso de uma camada líquida em formato de placa de 96 poços permite o rápido triagem de compostos terapêuticos inovadores, o que pode reduzir significativamente as longas horas passadas no laboratório realizando ensaios tradicionais de placas.

No dia anterior ao ensaio, plaque as células apropriadas para o vírus em questão, a fim de obter uma confluência de 90 a 100% no dia da infecção. As soluções estoque também podem ser preparadas no dia anterior ao ensaio. Primeiro, prepare uma solução fixadora contendo 10% de formaldeído em água destilada, misturando 5,56 mililitros de formaldeído estoque a 36% com 14,44 mililitros de água destilada. Em seguida, prepare a coloração com violeta cristal, consistindo de 1% de violeta cristal em etanol a 20%, diluído com água destilada. Depois, trabalhando em condições estéreis, prepare o meio de placa apropriado 2x para o tipo de células que está sendo utilizado. Filtre a solução através de um filtro de 0,2 mícron, caso algum dos reagentes não seja estéril. Para preparar uma cobertura líquida para uso no ensaio de placa, adicione 2,4 gramas de Avicel a um frasco contendo 97,6 mililitros de água destilada que esteja sendo rapidamente misturada com um bastão de agitação. Misture a solução à temperatura ambiente até que fique muito viscosa para o bastão de agitação. Nesse momento, transfira o frasco para um agitador e agite vigorosamente por 30 minutos para garantir uma homogeneização uniforme. Por fim, autoclave a solução a 121 graus Celsius e 14 PSI por 30 minutos.

E quando o programa terminar, armazene fechado à temperatura ambiente. Para uma sobreposição de agarose, prepare uma solução estoque de agarose a 0,6% em água destilada, misture com um bastão de agitação e autoclave para dissolver. Para uma sobreposição de carboximetilcelulose, prepare uma solução de carboximetilcelulose a 2% em água destilada e misture. Em seguida, autoclave como anteriormente.

No dia seguinte ao plaqueamento, utilize um microscópio invertido para verificar a confluência e a viabilidade das células antes de iniciar o ensaio. Certifique-se de que as células apresentem morfologia celular padrão e aproximadamente 90% de confluência.

Realize uma diluição seriada decimal das amostras infecciosas em meio de crescimento celular, variando o número de diluições necessárias com base no título esperado do vírus em questão. Além disso, prepare uma amostra controle não infectada para garantir independentemente a viabilidade celular e auxiliar na identificação das placas. Pipete o controle não infectado e as diluições seriadas nos poços da placa, tomando cuidado para não perturbar a monocamada.

Utilize um volume suficiente de inóculo para cobrir as células, mantendo o volume o mais baixo possível para maximizar o contato viral com a monocamada. Coloque as placas no incubador de cultura de tecidos e infecte as células por 45 minutos a uma hora. A cada 20 minutos, agite suavemente as placas para garantir uma cobertura uniforme e evitar que a monocamada celular seque.

Durante a infecção, prepare a solução de trabalho para coberturas líquidas. Misture meio para placas aquecido e Stock Avicel a 1,2 a 2,4% em temperatura ambiente em uma proporção de um para um, obtendo uma solução de trabalho com meio de cobertura contendo 0,6 a 1,2% de Avicel. Para coberturas de agarose ou CMC, misture meio para placas aquecido e uma solução estoque de agarose 0,6% aquecida ou CMC 2% em uma proporção de um para um. Em seguida, coloque em banho-maria a 56 graus Celsius por 30 minutos para equilíbrio térmico. Certifique-se de que a solução esteja morna, mas não quente ao toque, para evitar a morte celular e redução nos títulos virais. Após a infecção, aplique as coberturas sobre as monocamadas infectadas. Após a adição da cobertura, incube as placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por dois a 14 dias, dependendo do vírus analisado.

Para fixar as células com uma sobreposição líquida, despeje ou aspire a sobreposição de Avicel, em seguida pipete a solução de formaldeído a 10% nas cavidades e fixe à temperatura ambiente por 30 minutos a durante a noite. Para agarose ou CMC, adicione diretamente a solução de formaldeído à sobreposição por uma hora a durante a noite à temperatura ambiente. Após a fixação, descarte o formaldeído e, em seguida, remova manualmente os tampões semissólidos da agarose com a espátula.

Lave as placas celulares de Avicel com água para remover o fixador residual da sobreposição antes da coloração.

Para corar, cubra as células com uma quantidade mínima de solução de violeta cristal por aproximadamente 15 minutos. Agite suavemente as placas, se necessário, para garantir uma cobertura uniforme. Lave cuidadosamente o corante violeta cristal com água. Uma vez fixadas, coradas e secas, armazene as placas indefinidamente para análises futuras. Conte as placas em cada poço, desconsiderando poços com menos de cinco ou mais de 100 placas. Calcule a média de quaisquer réplicas técnicas da mesma diluição. Observe o tamanho e a morfologia das placas. Determine o título viral da amostra original tomando o número médio de placas para uma diluição e o inverso do fator total de diluição.

Esta imagem mostra comparações de sobreposição de placas do vírus da febre do Rift Valley utilizando placas de 12 poços. Células Veros foram semeadas a 2,5 vezes 10 à quinta células em placas de 12 poços e infectadas com 200 microlitros usando a mesma amostra inicial diluída em série do MP 12. Após a infecção, foram aplicadas sobreposições de 1,5 mililitro contendo agarose 0,3%, Avicel 0,6% ou CMC 1% para comparação direta das sobreposições. Este histograma mostra os resultados das contagens de placas e titulações para as três sobreposições. Aqui são apresentadas comparações de sobreposição de placas do VEEV utilizando placas de 12 poços. As células Veros foram semeadas como anteriormente e infectadas com um volume de 200 microlitros usando a mesma amostra inicial diluída em série da cepa vacinal VEEV-TC 83; após a infecção, foram aplicadas sobreposições de 1,5 mililitro de agarose 0,3%, Avicel 0,6% celular ou CMC 1%, como antes.

Novamente, o histograma mostra os resultados das contagens de placas e titulações para as três coberturas. Esta imagem mostra um exemplo de coberturas de placas de alto rendimento. Uma placa de 96 poços com células Veros semeadas a três vezes 10 à quarta células por poço foi infectada com 50 microlitros de inóculo utilizando a mesma amostra inicial diluída em série do vírus da febre do Vale do Rift MP 12, durante uma hora em quadruplicata. Para as coberturas, foram testadas concentrações finais de 0,6 e 1,2% de Avicel cell para determinar a viabilidade e reprodutibilidade do uso de coberturas líquidas de maneira de alto rendimento. Este histograma mostra as titulações determinadas a partir de cada cobertura.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que cada vírus é diferente e podem ser necessárias otimizações, incluindo o uso de diferentes tipos celulares, tempos de incubação e/ou meios de crescimento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar um ensaio de placa básico utilizando camadas líquidas e semissólidas.