Um ensaio colorimétrico que mede Especificamente granzima B Actividade proteolítica: Hidrólise de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl
28 de novembro de 2014
Descrevemos um ensaio colorimétrico simples e quantitativo que mede especificamente a atividade proteolítica da Granzyme B (GzmB) humana, de camundongo ou de rato. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para determinar a atividade da protease de outras proteases de serina de grânulos pela hidrólise de outros substratos peptídicos sintéticos com uma sequência de reconhecimento apropriada.
O objetivo geral do experimento a seguir é medir a atividade proteolítica da ine protease granzima B. Isso é alcançado primeiro preparando um lisado das células de interesse e, em seguida, adicionando rapidamente substrato às amostras. A atividade da granzima B é então medida por uma reação colormétrica. Em última análise, a clivagem altamente específica de alla alla as s benzo pela granzima B pode ser avaliada com base em sua especificidade de substrato única para resíduos de ácido parcial.
A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a detecção da expressão da zona B por PCR ou Western blot, é que a hidrólise da benzila é específica para a zona B e também indica que a protease está ativa. Para preparar a célula, os lisados primeiro isolam as células NK primárias das suspensões unicelulares de baços de seis pretos selvagens tipo C 57 ou controlam camundongos nulos do gene granzima B por seleção negativa usando kits disponíveis comercialmente de acordo com as instruções do fabricante após as células terem sido ativadas. Lave a cultura três vezes em PBS na velocidade máxima por dois a três segundos e, em seguida, ressuspenda o pellet contendo um mínimo de 5 milhões de células NK em 100 microlitros de tampão de lise Nont P 40 em gelo por 20 minutos.
Em seguida, gire o lisado em uma microcentrífuga por 10 minutos a 15.000 Gs e transfira o agente supino para um novo tubo. Depois de determinar a concentração de proteína, de acordo com o protocolo apropriado disponível comercialmente, armazene o sato a um mínimo de aproximadamente dois miligramas por mililitro de concentração a 20 graus Celsius negativos para realizar um ensaio de atividade de grande zima B. Em seguida, diluir um mínimo de 100 microgramas de lisado de proteínas por amostra em tampão recém-preparado até um volume final de 160 microlitros.
Em seguida, usando uma pipeta multicanal, carregue 50 microlitros de amostra por poço em triplicata em uma placa inferior de vinil U de 96 poços. Tomando o cuidado de incluir três poços de controle apenas tampão, adicione 100 microlitros de DTNB diluído a cada um. Bem, então adicione rapidamente 50 microlitros de substrato de benzoíla alala pede s recém-diluído a cada um dos poços de tampão sozinho, seguido por quaisquer controles negativos e terminando com as amostras positivas esperadas.
Meça a atividade da aase pela hidrólise da alala como benzila em um leitor de microplacas com uma densidade óptica de 405 nanômetros usando um protocolo de ensaio cinético fazendo 25 leituras a cada 15 segundos. Finalmente, use o software leitor de placas para calcular a taxa máxima de clivagem do substrato para cada poço e, em seguida, transfira os dados brutos para o software de análise estatística apropriado usando camundongos nocaute do gene granzyme. Descobriu-se que o substrato peptídico sintético alala como benzil é especificamente hidrolisado pela granzima B. A clivagem robusta do substrato sintético pode ser medida em lisados celulares de células NK primárias de tipo selvagem, mas não em células NK de animais nocautes para granzima B como controle.
Neste experimento, a atividade proteolítica da granzima A, que tem especificidade de substrato semelhante à tripsina e está presente em lisados de ambos os tipos de células, foi igual à medida pela hidrólise da benzila BLT, I-E-P-D-P-N-A tem sido usado genericamente para testar a atividade da granzima B entre as espécies. Neste experimento representativo, a análise das sequências tetrapeptídicas revelou que a granzima B humana, mas não de camundongo, pode clivar eficientemente após a sequência IEPD, que corresponde à sequência de reconhecimento em humanos e camundongos. Em contraste, diminuir a quantidade de lisado de células de leucemia NK humana de 30 microgramas para 10 microgramas ainda resulta em enzima B de grama suficiente para hidrolisar o substrato I-E-P-D-P-N-A.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como escolher o substrato apropriado e os controles experimentais para a análise in vitro da enzima B vermelha humana e de camundongo.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um ensaio colorimétrico quantitativo para medir a atividade proteolítica da Granzima B (GzmB) em amostras humanas, de camundongo ou de rato. O método pode ser adaptado para outras proteases séricas de grânulos utilizando diferentes substratos peptídicos sintéticos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Atividade de protease
- Biologia celular
Contexto
- A granzima B é uma protease serina envolvida nas respostas imunes.
- A medição de sua atividade é fundamental para compreender seu papel na citotoxicidade mediada por células.
- Métodos existentes, como PCR ou Western blot, não medem diretamente a atividade da protease.
- Este ensaio fornece uma medição específica e direta da atividade de GzmB.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um ensaio simples para quantificar a atividade da GzmB.
- Fornecer um método que possa ser adaptado para outras proteases.
- Aprimorar técnicas existentes ao oferecer especificidade para a atividade da GzmB.
Métodos Utilizados
- Preparação de lisados celulares de linfócitos NK primários.
- Uso de uma reação colorimétrica para medir a atividade da GzmB.
- Isolamento de células NK de baços de camundongos selvagens e nulos para o gene da granzima B.
- Hidrólise do substrato para avaliar a atividade de protease.
Resultados Principais
- O ensaio mede com sucesso a atividade da GzmB por meio da clivagem específica do substrato.
- Ele demonstra alta especificidade para a GzmB em comparação com outros métodos.
- Os resultados indicam que a protease está ativa com base na hidrólise do substrato.
- O método é adaptável para outras proteases serina de grânulos.
Conclusões
- O ensaio desenvolvido é uma ferramenta confiável para medir a atividade da GzmB.
- Oferece vantagens em relação aos métodos tradicionais ao avaliar diretamente a função da protease.
- Essa abordagem pode aprimorar a pesquisa sobre respostas imunes e biologia das proteases.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A medição precisa da atividade proteolítica da Granzima B é essencial para validar a função dos linfócitos citotóxicos no desenvolvimento de imunoterapias. Este ensaio colorimétrico fornece uma leitura direta e específica da atividade da protease, permitindo a redução de riscos mecanicistas do engajamento do alvo e do potencial pró-apoptótico em modelos pré-clínicos. Sua compatibilidade entre espécies apoia a continuidade translacional dos estudos em roedores para aplicações humanas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de vias de apoptose dependentes da granzima B em linfócitos citotóxicos.
- Valor Operacional: Distingue a protease ativa da mera expressão, reduzindo falsos positivos na validação de alvos.
- Valor Preditivo: Apoia a confirmação funcional da granzima B como fator mecanicista na eliminação imunomediada de tumores.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Utiliza o substrato Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl, hidrolisado exclusivamente pela Granzima B em sistemas humanos, de camundongo e de rato.
- Saída Quantitativa: Mede as taxas iniciais de hidrólise por meio de reação colorimétrica acoplada ao DTNB a 405 nm para análise cinética.
- Controle de Especificidade: Exclui interferência de caspases e outras granzimas devido à preferência única por aspartato.
- Reprodutibilidade: Compatível com lisados não fracionados e proteases recombinantes quando controles adequados são incluídos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Aplicável a modelos de imunovigilância tumoral, infecção viral e patologia autoimune em que a granzima B media a morte celular alvo.
- Continuidade Tradutiva: Permite a medição consistente da atividade entre espécies, apoiando a extrapolação de dados de camundongo para humanos.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Fornece um biomarcador baseado na atividade para priorizar candidatos com potencial citotóxico confirmado.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se na sequência de descoberta, desde a validação do alvo até a otimização do composto inicial, onde a atividade funcional da protease fornece informações sobre a eficácia biológica e o mecanismo de ação.
- Biologia da Descoberta: Confirma a hipótese de que a Granzima B induz apoptose em linfócitos efetores por clivagem específica de substrato.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas padronizadas de atividade para comparação entre condições ou perturbações genéticas.
- Análises: Gera dados cinéticos (Vmax) que permitem comparação entre amostras e avaliação estatística da capacidade proteolítica.
- Pesquisa Translacional: Apoia a validação pré-clínica ao verificar a atividade conservada entre Granzima B humana, de camundongo e de rato.
- Reutilização Empresarial: Plataforma adaptável a outras proteases de grânulos mediante substituição de substrato, aumentando a utilidade a longo prazo.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: A medição direta da função proteolítica reduz a dependência de marcadores indiretos, como níveis de mRNA ou proteína.
- Valor Operacional: Formato simples, baseado em placas, com tempo mínimo de manipulação manual e compatibilidade com leitores padrão de microplacas.
- Valor Estratégico: Permite decisões de avanço ou interrupção com base na atividade funcional, e não apenas na expressão, melhorando a confiança preditiva.
- Impacto no Portfólio: Facilita o avanço de imunoterapias com ajuste de risco ao confirmar a potência mecanicista no início do desenvolvimento.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no isolamento de células imunes primárias e na sua lise sob condições controladas para preservar a atividade de proteases.
- Depende do acesso a um leitor de microplacas capaz de realizar medições cinéticas de OD405 e software de análise compatível.
- Necessita da inclusão de controles com ausência de Granzima B para confirmar a especificidade do ensaio, conforme demonstrado na fonte.
- A adaptação a outras proteases exige a validação de substratos alternativos para manter especificidade e janela de sinal equivalentes.
- Limitação prática: o ensaio mede a atividade total do lisado e pode exigir fracionamento para estudos de localização subcelular.
