Automated Quantificação de células hematopoiéticas - Interações de células estromais em imagens histológicas de osso não descalcificadas

O objetivo geral deste procedimento é quantificar as associações entre subconjuntos de células específicas na medula óssea. Isso é feito coletando primeiro seções criogênicas histológicas de tumores de fêmures de camundongos. Na segunda etapa, os cortes são corados para análise imunofluorescente e as imagens confocais são adquiridas.

As imagens são então analisadas digitalmente. Em última análise, as posições dos diferentes tipos de células podem ser simuladas para calcular as taxas e a frequência de contato entre as células imunológicas específicas de interesse e seu microambiente. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando estávamos analisando nichos microambientais para células plasmáticas de vida longa na medula óssea, e precisávamos de um método para quantificar inequivocamente as associações celulares dentro do tecido da medula óssea.

RA Maya demonstrará o procedimento para você Para crioaspiração de ossos femorais de um camundongo adulto. Primeiro, configure a amostra e a temperatura da lâmina de um micrótomo padrão equipado com uma lâmina de tecido duro para 24 graus Celsius negativos. Após uma aclimatação de 15 minutos.

Fixe um sample bloco no metal sample suporte com meio de incorporação criogênica e ajuste a orientação do bloco conforme necessário. Apare a amostra até que o osso esteja totalmente aberto e a medula fique visível. Em seguida, ajuste a espessura de uma seção para sete mícrons.

Em seguida, fixe um pedaço de fita adesiva kawamoto com o lado adesivo na parte superior de um bloco de amostra usando uma espátula de madeira coberta de couro Seção a amostra e usando uma pinça. Gire a fita para que a seção fique posicionada na parte superior. Em seguida, transfira a fita para uma lâmina de microscópio de vidro.

Fixe a fita na lâmina de vidro com fita adesiva quando a última seção for coletada. Deixe as amostras conduzirem por pelo menos 30 minutos e armazene as lâminas a 80 graus Celsius negativos. Duas mulheres imaginam as amostras corando as seções criogênicas descongeladas de acordo com protocolos comuns de imunofluorescência.

Certifique-se de incluir uma coloração nuclear para visualizar a integridade do tecido. Depois que as seções forem tingidas, adicione uma gota de suporte de piso a cada amostra, seguida por uma lamínula de vidro número um em um microscópio confocal de varredura a laser. Selecione a lente objetiva de 20 x e defina um campo view de 708 ponto 15 por 708 ponto 15 mícrons.

Em seguida, imagine as amostras uma de cada vez em 2048 por 2048 pixels por imagem para manter os resultados comparáveis. Gravação das imagens em um canal para visualização das estruturas estromais, um canal para os núcleos e canais adicionais para as células hematopoiéticas de interesse, conforme necessário. Grave as imagens usando a média de linha.

Idealmente, capturando imagens adjacentes únicas para cobrir toda a seção femoral. Em seguida, salve as imagens em um formato de arquivo de imagem de microscopia. Em seguida, exporte um arquivo JPEG por canal para cada área fotografada e use uma ferramenta de análise de imagem para realizar a quantificação de segmentação de imagem de colocalização e análise de vizinhança antes de executar as simulações da célula aleatória.

Posicionamento nas imagens de medula óssea analisadas para cada imagem a ser simulada. Coloque os seguintes arquivos em uma única pasta, os arquivos CSV únicos fornecidos pela ferramenta de contato da célula. Os arquivos JPEG do canal DPI original e os arquivos JPEG do canal estromal original para realizar simulações em lote na série de imagens de uma única amostra femoral para transferir todos os arquivos JPEG originais e seus arquivos CSV únicos correspondentes para outra pasta neste momento também.

Quando todos os arquivos estiverem montados, inicie a ferramenta de simulação. Em seguida, marque a caixa de carregamento automático de dados da imagem. Com esta opção marcada, os arquivos CSV correspondentes às imagens analisadas são abertos automaticamente.

Em seguida, insira a tag comum para os arquivos CSV e o número de conjuntos de imagens que devem ser usados para simulação em modo de lote. Em seguida, carregue o arquivo J peg gerado a partir do canal S stroma com um nome de arquivo terminado em três para gerar a máscara para o canal DPI. Marque a caixa aplicar máscara e defina o limite para converter a imagem DPI em uma máscara binária como 10.

Marque as caixas de oito bits e dilatação e defina o grau de dilatação para cinco pixels. Em seguida, marque a caixa de erosão de largura. Em seguida, insira o valor desejado para o raio de vizinhança usado para a análise das imagens simuladas e marque a caixa usar OSU para usar o algoritmo OSU para a detecção automática das estruturas estromais das células hematopoiéticas.

Simulado como formas circulares. Meça a distribuição do tamanho das células dos tipos de células analisadas com qualquer software de análise de imagem que inclua as funções apropriadas de segmentação de objetos e determine o sigma para todos os tipos hematopoiéticos dessas medições. O limite de tamanho da célula, ou seja, o diâmetro em pixels que descreve o menor objeto ainda reconhecido como a célula completa pela ferramenta de análise de imagem, pode ser determinado.

Em seguida, insira o corte de tamanho da célula e o sigma em pixels para a simulação da distribuição do tamanho da célula para as células vermelha, verde e azul. Em seguida, na guia células e máscara, marque a caixa de exclusão para permitir que o programa escolha uma nova posição para uma célula se ela se sobrepuser a pelo menos um pixel dentro de uma área proibida da máscara. Na guia de exclusão de células, marque também a caixa evitar sobreposição de células.

Em seguida, insira a distância mínima permitida entre os centros de duas células em pixels. Se a sobreposição for definida pela distância mínima do centro de uma célula ao centro de outra, defina a área máxima de sobreposição para 100%Em seguida, defina a ferramenta de simulação para 1000 repetições. Em seguida, marque a caixa de salvamento automático de vendas para salvar as coordenadas dos objetos simulados para todas as repetições de cada imagem do lote como arquivos destruídos em formato de texto.

Insira também uma tag comum para os arquivos salvos. Por fim, clique em executar simulação e determine as frequências médias de contato e vizinhança dos conjuntos de 1000 imagens simuladas correspondentes a cada imagem gravada. Para essa divisão, o contato médio e a vizinhança contam pela contagem de células gravadas por imagem e comparam as frequências com os resultados da análise automatizada de colocalização da imagem gravada.

Nesta figura, é apresentada uma análise de localização de eosinófilos, plasmócitos e células B com o microambiente de células estromais com medula óssea quimérica fluorescente. Os arquivos CSV gerados pelas ferramentas de contato e vizinhança da célula contêm a contagem de células e a área total de cada população de células em pixels, bem como as contagens de contato ou vizinhança. Antes de realizar uma simulação do posicionamento aleatório da célula, os parâmetros que descrevem a distribuição do tamanho da célula como uma distribuição gaussiana devem ser determinados nesta simulação, os valores relativos do sigma medidos para as três populações de células foram mantidos.

Enquanto os valores Sigma definidos em pixels foram definidos para corresponder à aparência visual das células gravadas para definir as áreas onde as células podem ser colocadas, uma máscara foi gerada a partir do canal DAPI. Um valor de 10 foi então determinado como o limite de densidade ideal para gerar as imagens binárias. A relevância dos contatos das células plasmáticas, eosinófilos ou células B com as células estromais foi então testada conforme o esperado.

Essas análises revelaram taxas de contato significativamente mais altas nas imagens gravadas em comparação com a simulação para as células plasmáticas e células B. Em contraste, nenhuma diferença clara observada para o contato com células estromais eosinófilas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em qualquer campo que exija a análise da complexa estrutura tecidual da medula óssea, como imunologia, hematologia, patologia ou biologia de células-tronco.