In Vivo Dinâmica da Retinal microglia Ativação Durante Neurodegeneration: confocal oftalmoscópico Imagem e morfometria celular no mouse Glaucoma

O objetivo geral do experimento a seguir é caracterizar a dinâmica microglial em um modelo de camundongo de glaucoma crônico por imagem confocal in vivo da retina. Isso é obtido por oftalmoscopia confocal mensal não invasiva ou CSLO para visualizar a microglia fluorescente na retina e na cabeça do nervo óptico. A análise de imagem ao vivo usando segmentação SOMA de célula baseada em limiar e morfo quantifica as mudanças no número e ativação de células microgliais.

Os resultados mostram que a imagem CSLO mensal em camundongos vivos pode ser usada para monitorar a cinética da distribuição da densidade celular microglial e a ativação morfológica durante a progressão inicial da neurodegeneração crônica. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a imagem confocal de dois fótons do cérebro de camundongo com micróglia positiva para GFP, é que a imagem CSLO da retina permite a observação direta e o monitoramento das células microgliais ao longo da progressão dos distúrbios neurodegenerativos do envelhecimento no organismo intacto. Tive a ideia para este método depois que demonstramos exvivo, que a microglia mostrou intensa ativação e agrupamento na prontidão central de camundongos jovens DBA a J em idades que precederam a neurodegeneração detectável.

Para perguntar se essas alterações imunes inatas iniciais que precederam o glaucoma detectável causaram sua neurodegeneração, precisávamos estabelecer uma abordagem in vivo para rastrear as alterações microgliais. Demonstrando o procedimento para aquisição de imagens ao vivo estará Caesar Romero, um técnico do meu laboratório Para iniciar as operações, inicie o sistema CSLO e insira as informações da sessão. Em seguida, prepare-se para a imagem com segurança.

Conecte uma lente objetiva de campo amplo de 55 graus limpa. Coloque o mouse sobre a plataforma de imagem dois minutos após a administração do anestésico e dilate ambas as pupilas usando minhas gotas táticas. Cinco minutos depois, confirme se o mouse está anestesiado.

Em seguida, usando pressão mínima, cubra cada olho com lentes de contato. Oriente o mouse de forma que o olho direito encontre a lente objetiva e a órbita fique paralela à lente. O animal não precisa ser contido, mas mantido a uma distância constante da lente objetiva.

Com o olho alinhado com ele pelos próximos 10 a 15 minutos, o mouse não se moverá ou piscará enquanto seus movimentos oculares são rastreados pelo sistema de imagem ao vivo CSLO. Inicie a sessão de imagem coletando uma visão de fundo de olho da retina interna. Para isso.

Selecione o modo infravermelho, que corresponde a um comprimento de onda de excitação de 820 nanômetros. Em seguida, ajuste a potência do laser para 100% e a sensibilidade para entre 40 e 60% Em seguida, trabalhando em alta velocidade, localize o olho usando o joystick para orientar o oftalmoscópio e prepare-se para coletar uma visão do fundo do disco óptico e da vasculatura da retina. Inspecione a córnea e o cristalino quanto a ferimentos ou opacidade.

Excluir do estudo olhos com defeitos ou lesões que possam afetar a aquisição da imagem. Agora, aproximando a objetiva do olho, localize a área do disco óptico, que é a superfície da cabeça do nervo óptico ou ONH. Em seguida, centralize a imagem no ONH.

Posicionar o ONH corretamente é fundamental para obter um foco e uma missão uniformes em toda a imagem. O próximo passo é visualizar os planos internos da retina, bem como o ONH. Para um plano focal de referência, use os principais vasos sanguíneos localizados na superfície vítrea da retina, que corresponde a 59 e 60 dioptrias, ou ainda mais profundamente a 55 dioptrias em áreas de disco óptico escavadas.

Em seguida, ajuste a saturação da imagem usando o botão no painel de toque até que um halo branco de iluminação abranja a maior parte do fundo ao redor do disco óptico. Em seguida, selecione a saturação mais baixa que torna um halo uniforme indicativo de um contraste ideal para esse olho. Pode ser necessário realinhar a câmera se as áreas escuras persistirem.

Agora, colete uma imagem de fundo de olho de alta resolução da retina central, com uma média de 30 quadros tirados em tempo real para melhorar a relação sinal-ruído. Isso corresponde a 4,7 quadros por segundo, normalizados imediatamente e na mesma posição preparada para coletar uma imagem de fluorescência das células GFP positivas. Mude para o modo de imagem de fluorescência no painel da tela sensível ao toque, que seleciona o laser azul com excitação de laser de 488 nanômetros e um conjunto de filtros de barreira de 460 a 490 nanômetros e defina a aquisição para 100% de potência do laser e 100 a 125% de sensibilidade.

Agora colete uma única imagem de fluorescência bidimensional de ponto XY do ONH com média de 100 varreduras x. Em seguida, capture uma imagem multiponto da retina ao redor do composto ONH select no painel de controle e, em seguida, mova com o oftalmoscópio no eixo temporal nasal. O software calcula automaticamente a média das áreas recém-digitalizadas e as une em tempo real.

Se a qualidade da imagem das áreas da retina for insuficiente para permitir a média, o círculo verde que identifica uma área que está sendo escaneada ficará vermelho. A imagem composta resultante cobre uma área de até 1,7 por quatro milímetros. Deve-se ter cuidado durante a aquisição da imagem composta.

As imagens em alta resolução podem ser perdidas movendo a objetiva muito rapidamente antes da conclusão da média da digitalização e da costura da imagem. Quando a anestesia começa a passar, a sessão de imagem deve terminar porque o camundongo começa a respirar pesadamente e a imagem se torna impraticável. Comece alinhando sequencialmente as imagens do fundo do olho para uma série temporal usando a vasculatura e o disco óptico como pontos de referência.

Usando um software de edição de imagem convencional, alinhe todas as imagens até que suas imagens se sobreponham. A imagem superior ficará semitransparente ao ser arrastada. Em seguida, gire cada imagem na sequência até que seus principais vasos sanguíneos se sobreponham à vasculatura da imagem anterior e salve o arranjo para referência futura.

Registre o ângulo corrigido para cada imagem e aplique-o à imagem de fluorescência de ponto XY único correspondente. Agora é possível identificar células microgliais positivas para GFP individuais localizadas na retina central abrindo os arquivos TIFF alinhados na renderização Fluor. Para visualizar todas as células, preencha a tela com a imagem e defina a visualização de renderização composta ortogonal e interpolada.

Em seguida, defina as propriedades 0,58 gama 255 ponto de saturação 255 luminância 195 alfa a 1,00 sombreamento. Conclua as seleções escolhendo os dois canais RG como visíveis. Oculte o canal B clicando duas vezes nele no quadro da área de trabalho para segmentar células individuais.

Selecione e limite o canal vermelho aumentando o limite baixo até que a maioria das células seja mascarada com sobreposição mínima e excluindo processos de célula, mantendo o limite alto constante. Por fim, salve o arquivo com células mascaradas usando o comando capture. Abra a imagem com células mascaradas no editor gráfico raster.

Inverta a escala de cinza para observação direta e ajuste a resolução para 300 DPI ou mais. A imagem RGB é salva como um arquivo TIF. O próximo passo da análise de imagens ao vivo é de microglial, portanto, segmentação e morfo para identificar SATA para quantificação de área.

Use um software capaz de medições de intensidade e contagem de objetos com base no limiar. Abra o arquivo TIFF com células segmentadas e selecione o redimensionamento de spline para resolução máxima e o canal vermelho como preto e branco para melhor visualização. Em seguida, calibre a imagem definindo seu diâmetro horizontal como 1,4 a 1,7 milímetros, dependendo da idade para segmentar células individuais.

Então, MA, aplique o limite de intensidade no canal vermelho. Abra a função de intensidade de limite no comando de contagem de objetos e atualização de conta. Use esta função para rastrear parâmetros bidimensionais para cada limiar de região de interesse que representa o indivíduo.

Então, em seguida, defina o limite de intensidade no histograma de intensidade. Selecione os 50 a 60% mais baixos dos 255 níveis e refine o valor limite final das células individuais. Avalie visualmente a sobreposição entre a máscara de cor de limite em azul e o perímetro soma da célula em cinza usando os controles binários da barra de ferramentas ou o catálogo de objetos.

Identifique manualmente regiões somais de interesse com várias células. Separe esses elementos separando as regiões de interesse. Ao fazer isso, use o botão de alternância para visualizar diretamente as células agora usando a restrição de área.

Classifique as células microgliais como ativadas. Se suas áreas somata forem maiores que 50 a 60 mícrons quadrados. Classifique a microglia como desativada se tiver somas menores.

Finalmente, verifique o processo e verifique a complexidade de ramificação em cada célula microglial ativada, sobrepondo a máscara somal e a imagem de ponto XY único com o contraste aumentado em 50%O protocolo descrito foi usado para visualizar células microgliais em uma grande área da retina central. Em camundongos jovens DBA dois J heterozigotos expressando CX três C um GFP, a alta resolução celular combinada com imagem ao vivo, limiar e análise morfométrica permitiu a segmentação automática de células GFP positivas individuais e, portanto, as células são discriminadas com base na área DBA dois camundongos J modelo de glaucoma crônico e foram visualizadas mensalmente para monitorar o desenvolvimento de microgliose local e ativação da microglia em idades que procedem à neurodegeneração detectável consistente com a variável progressão da neurodegeneração em olhos individuais. Esta análise revelou alterações na ativação da microglia retiniana e microgliose com o tempo.

A análise também detectou mudanças dinâmicas na densidade da microglia total e ativada nas retinas individuais. A densidade populacional da microglia não foi associada a mudanças na GFP expressando densidade celular consistente com outros achados. Assim, a análise de CSLO pode ser usada como um indicador de progressão precoce da doença.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de otimizar cuidadosamente os níveis de saturação da imagem fluorescente de GFP mais microglia, localizada na retina interna, a reprodutibilidade das imagens CSLO da retina central, bem como os detalhes celulares consistentes detectados em toda a retina central dependem criticamente desta etapa após seu desenvolvimento. Este protocolo de imagem ao vivo está sendo aplicado em nosso laboratório, realmente seda a ligação potencial entre as alterações precoces na microglia da cabeça da retina e do neurônio óptico e a progressão posterior do glaucoma em DBA para JM e em outros modelos de degeneração crônica da retina. Essa estratégia de imagem ao vivo também pode permitir a detecção precoce de outras patologias crônicas que também visam a retina e o nervo óptico para degeneração, como esclerose múltipla, doença de Alzheimer e Parkinson.