Custom-made Microdiálise Probe projeto
21 de julho de 2015
Microdiálise é uma técnica comumente usada em pesquisas de neurociência. Portanto sondas comerciais estão em grande demand.In neste trabalho um conjunto de sonda é explicado em detalhes para construir um concêntrico, sonda de microdiálise confiável, feito sob medida para menos de 10 dólares.
O objetivo geral deste procedimento é descrever o fabricante de uma sonda de microdiálise personalizada. Isso é feito cortando primeiro a tubulação de politetrafluoretileno e a sílica fundida nas dimensões corretas. O segundo passo é inserir a sílica fundida na tubulação usando uma cânula como orientação.
Em seguida, uma membrana de diálise é posicionada sobre a sílica fundida. A etapa final é puxar a luva de metal para a parte restante da sílica fundida e usar epóxi para fechar as juntas e garantir um comprimento de troca de dois milímetros. Por fim, as instruções neste vídeo mostrarão como construir uma sonda de microdiálise feita sob medida robusta e confiável como uma alternativa a uma sonda comercial, que pode medir com precisão a recuperação in vitro de neuropeptídeos e pequenas moléculas.
A principal vantagem desta técnica é que este conjunto de sonda de microdiálise apresentado em detalhe pode ser adaptado a qualquer aplicação e pode ser fabricado para menos de 10. Para começar, corte um pedaço de tubo de politetrafluoretileno de 1,6 milímetro de espessura com um diâmetro interno de 350 mícrons em seções de 2,5 centímetros de comprimento. Corte uma extremidade da seção em um ângulo de 45 graus para facilitar a conexão da tubulação de saída.
Em seguida, use uma lixa para tornar áspera a superfície externa do tubo de PTFE para promover a adesão de uma cola epóxi. Corte uma seção de sílica fundida em um pedaço de 2,25 centímetros de comprimento. Insira uma agulha de calibre 30 na fibra oca de PTFE a um centímetro da extremidade plana.
Dobre o PTFE e perfure a bainha na curva. Insira a sílica fundida no tubo de PTFE usando a cânula da agulha como orientação. Em seguida, remova cuidadosamente a cânula da agulha e posicione a sílica fundida de forma que cinco milímetros se projetem para fora da extremidade plana do tubo de PTFE.
Use uma gota de cola de cianoacrilato para prender a sílica fundida no local da punção e deixe-a endurecer durante a noite. Prepare a cola epóxi adicionando 30 partes de endurecedor amarelo a 70 partes de cola epóxi preta e misturando suavemente. Em seguida, puxe uma membrana de diálise de polissulfona de corte de 30 kilodalton com um diâmetro interno de 210 mícrons e um diâmetro externo de 245 mícrons.
Cuidadosamente sobre a sílica fundida. Puxe a membrana para dentro do tubo de PTFE e ajuste a membrana para 5,5 milímetros usando um bisturi afiado. Marque um ponto na membrana com uma caneta fina para definir o comprimento de troca de dois milímetros a partir da extremidade da membrana.
Em seguida, use uma agulha fina para aplicar uma pequena quantidade de cola epóxi para cobrir a ponta da membrana. Em seguida, use cola epóxi para fechar a junta entre a membrana de diálise e a fibra de PTFE. Agora volte e adicione cola epóxi suficiente na membrana até o ponto de marcação.
Para garantir um comprimento de troca de difusão de apenas dois milímetros, deixe a cola epóxi endurecer durante a noite. Use um alicate para quebrar cuidadosamente pedaços de um centímetro de uma agulha de calibre 25 para criar mangas de metal. Em seguida, puxe a luva de metal para a parte restante da sílica fundida e use a cola epóxi restante para vedar a junta entre a luva de metal e a tubulação de PTFE.
A luva de metal permite posteriormente a conexão da tubulação de entrada com uma sonda de microdiálise. Por fim, aplique cola quente ao redor da bifurcação da sonda para fixação e estabilização adicionais do dispositivo. Este esquema mostra um close-up do funcionamento interno da sonda de microdiálise.
Dois milímetros da membrana de diálise de polissulfona são expostos na extremidade da sonda, o que permite a recuperação de metabólitos de pequeno peso molecular, como glicose, TP e acetilcolina. A capacidade da sonda de recuperar moléculas pequenas e de baixo peso molecular, como glicose, lactato, acetilcolina e um TP in vitro, é mostrada aqui. A porcentagem de recuperação é muito maior com essas moléculas, que estão em torno de 500 Daltons do que moléculas maiores, como angiotensina dois, substância p e somatostatina, que estão acima de 1000 Daltons.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como construir sondas de microdiálise robustas e confiáveis como alternativa às comerciais.
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Visão Geral
Este artigo descreve o processo de fabricação de uma sonda de microdiálise personalizada, que é uma alternativa economicamente viável às sondas comerciais. O procedimento delineia os passos necessários para criar uma sonda confiável capaz de medir neuropeptídeos e moléculas pequenas in vitro.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Técnicas de Microdiálise
- Fabricação de Sondas
Contexto
- A microdiálise é amplamente utilizada na pesquisa em neurociência.
- Existe uma grande demanda por sondas de microdiálise confiáveis.
- Sondas fabricadas sob encomenda podem ser mais econômicas do que as opções comerciais.
- Compreender a construção dessas sondas pode aprimorar as capacidades de pesquisa.
Objetivo do Estudo
- Fornecer instruções detalhadas para a construção de uma sonda personalizada de microdiálise.
- Oferecer uma alternativa acessível às sondas comerciais.
- Garantir a medição precisa de neuropeptídeos e moléculas pequenas.
Métodos Utilizados
- Recortar tubos de politetrafluoretileno e sílica fundida em dimensões específicas.
- Inserir a sílica fundida no tubo com uma cânula para orientação.
- Posicionar uma membrana de diálise sobre a sílica fundida.
- Fixar o conjunto com uma luva metálica e epóxi para garantir durabilidade.
Resultados Principais
- Um microdialisador confiável e resistente pode ser construído sob medida.
- O microdialisador é capaz de medir com precisão a recuperação in vitro de neuropeptídeos.
- O custo total da montagem do microdialisador é inferior a 10 dólares.
Conclusões
- As sondas de microdiálise personalizadas são uma alternativa viável às opções comerciais.
- Instruções detalhadas podem capacitar pesquisadores a criar suas próprias sondas.
- Este método pode aumentar a acessibilidade das técnicas de microdiálise na pesquisa em neurociência.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A fabricação personalizada de sondas de microdiálise oferece uma solução econômica para pesquisas em neurociência, permitindo o monitoramento preciso da dinâmica neuroquímica no líquido cefalorraquidiano. Ao reduzir os custos da sonda para menos de 10 dólares, este método aumenta a acessibilidade para instituições públicas e favorece a implantação em larga escala em estudos pré-clínicos. A abordagem facilita a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas ao fornecer dados confiáveis de recuperação de moléculas pequenas e neuropeptídeos, orientando decisões de avanço ou interrupção em fases iniciais de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da recuperação quantitativa de glicose, lactato, acetilcolina, ATP e neuropeptídeos na faixa de 100-1.600 Da.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica ao fornecer métricas reprodutíveis de recuperação in vitro (~20% para moléculas pequenas, 2-6% para neuropeptídeos) para esclarecer o engajamento do alvo e a modulação da via.
- Valor Preditivo: Gera insights mecanicistas que melhoram a triagem de portfólios ao diferenciar os efeitos dos compostos com base no peso molecular e nas propriedades físico-químicas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho subsequentes, estabelecendo uma membrana de diálise com corte molecular definido (30 kDa) e comprimento de troca (2 mm).
- Valor Operacional: Promove a padronização e reprodutibilidade dos ensaios por meio de dimensões de sonda consistentes e desempenho da membrana uniforme entre diferentes classes de substâncias.
- Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma e sua adaptação a comprimentos de troca maiores para diversos modelos animais, apoiando a preparação para triagem em alta produtividade.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta medições neuroquímicas na fase de descoberta à validação pré-clínica por meio do monitoramento de substâncias relevantes para a patologia da doença.
- Avanço Ajustado ao Risco: Orienta decisões pré-clínicas de prosseguir ou não com base em dados quantitativos de recuperação que refletem a permeabilidade da barreira hematoencefálica e a acessibilidade ao alvo.
- Alinhamento de Biomarcadores: Apoia o desenvolvimento de biomarcadores translacionais ao permitir a detecção de neuropeptídeos e metabólitos no fluido extracelular.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses até a identificação de compostos líderes, fornecendo leituras neuroquímicas quantitativas que apoiam a compreensão mecanicista e a priorização de compostos.
- Biologia da Descoberta: Facilita a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao medir a recuperação in vitro de neurotransmissores e metabólitos endógenos.
- Triagem: Fornece sistemas prontos para ensaio com resultados reprodutíveis para avaliar os efeitos de compostos sobre o fluxo neuroquímico.
- Análise: Oferece medidas quantitativas de variáveis dependentes (porcentagens de recuperação) que permitem comparação entre condições e análise de relações estrutura-atividade.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta ao trabalho pré-clínico gerando dados relevantes para o engajamento de alvos em sistemas relacionados a doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade reutilizável de monitoramento neuroquímico que pode ser adaptada entre projetos e sistemas modelo.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista por meio da medição neuroquímica direta.
- Valor Operacional: Garante padronização, reprodutibilidade e escalabilidade por meio da montagem de sondas de baixo custo e personalizáveis.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção de projetos e a eficiência do capital ao permitir a eliminação precoce de riscos biológicos na fase de descoberta.
- Impacto sobre o Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco por meio de dados confiáveis de recuperação que orientam os critérios de avanço.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em princípios de microdiálise, manipulação de membranas e técnicas de ligação adesiva.
- Necessita de instrumentação para corte preciso (bisturi, pinça), preparação de superfície (papel de lixa) e cura (epóxi ou cola quente por período noturno).
- Exige padronização entre equipes quanto às dimensões da sonda, comprimento de troca e preparação da membrana para resultados reprodutíveis.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes limites de peso molecular, materiais da membrana e comprimentos de troca entre sistemas modelo.
- Inclui limitações práticas, como tempo de montagem manual, reprodutibilidade dependente da habilidade e necessidade de validação in vitro por lote.
