Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS) para intracelular Segmentação Aplicações

O objetivo geral deste procedimento é sintetizar populações ultra pequenas de nanopartículas biocompatíveis, caracterizar suas propriedades físicas e investigar as interações das células de partículas. Isso é feito primeiro usando o método de temperatura de inversão de fase para sintetizar as nanopartículas lipídicas. Durante este processo, o lipídio e o surfactante são inicialmente co-fundidos.

Depois de adicionar uma quantidade específica de água, a mistura é aquecida até que ocorra a separação de fases. A mistura é então agitada continuamente até que uma nanoemulsão seja criada e a síntese de nanopartículas lipídicas sólidas ou sln esteja completa. Em seguida, o espalhamento dinâmico de luz ou DLS é usado para medir o tamanho das partículas e a dispersão poli.

A calorimetria exploratória diferencial ou DSC é uma técnica adicional usada para determinar o ponto de fusão e o calor latente de fusão, a fim de caracterizar ainda mais as partículas, em última análise, a microscopia de fluorescência e a citometria de fluxo podem ser usadas para investigar as interações das células de partículas. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos de alta energia existentes, como microfluido de ultrassonografia e homogeneização de alta pressão, é que esta é uma técnica de síntese comparativamente suave, que é simples e escalável. Para sintetizar o LNS, combine 0,6 miligramas de corante fluorescente ou outro composto lipofílico e 0,10 gramas de alcano linear ou lipídio.

Em um frasco de 15 mililitros, derreta os componentes a 90 graus Celsius e mexa, adicione 0,11 gramas de um surfactante linear não iônico. Em seguida, misture a mistura resultante a 90 graus Celsius e mexa. Em seguida, adicione 1,79 gramas de água estéril ao calor da mistura a 90 graus Celsius e monitore visualmente a solução até que duas fases sejam observadas.

Agora mexa a mistura até formar uma nano emulsão transparente. Prepare uma nanoemulsão separada em paralelo sem adicionar o corante fluorescente para servir como amostra de controle. Esterilize ainda mais cada nanoemulsão usando um filtro estéril de 0,2 mícron.

Empregar DLS para medir o tamanho das partículas e a polidispersividade dos S lns usando um vidro em um projeto de instrumento para medir o tamanho das partículas antes da medição das amostras, o tamanho das partículas de dois padrões conhecidos deve ser medido seguindo o protocolo do fabricante para a preparação e medição dos padrões. Em seguida, meça as amostras preparadas para cada uma. Use um tempo de execução de 100 segundos, o índice de refração da água e a viscosidade da água a 20 graus Celsius.

Relate o diâmetro médio das partículas e a polidispersidade da distribuição do tamanho das partículas para investigar o comportamento térmico dos S lns usando DSC primeiro pipete o S LNS em uma panela de alumínio de 40 microlitros com uma massa de aproximadamente 25 miligramas. Selar hermeticamente a panela usando uma prensa de crimpagem universal para minimizar a perda de umidade durante a varredura DSC. Antes de medir cada nano emulsão de cinco a 80 graus Celsius, relate o ponto de fusão e o calor latente de fusão do gráfico DSC, onde o vale representa o ponto de fusão e a integral da área sob a curva.

No gráfico DSC, dividido pela quantidade de material representa o calor latente da cultura de fusão. Fibroblastos humanos primários de acordo com as instruções do fabricante em meio líquido para a cultura de fibroblastos dérmicos humanos. Suplementado com o kit de suplemento de baixo crescimento sérico, mantenha as células em uma atmosfera umidificada a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e subcultura ao atingir 80% de confluência para células de sementes de MTT e análise de imagem.

Em uma placa de 96 poços com uma densidade de 20.000 células por poço. Permitir que as células se equilibrem a 37 graus Celsius durante a noite antes da exposição ao SLN no tempo zero, diluir s SLMs em meio completo para atingir a concentração lipídica desejada e adicionar 10 microlitros por poço a cada poço replicado na placa de 96 poços após 24 horas de incubação com S lns, determinar a viabilidade celular usando o ensaio MTT de acordo com o protocolo do fabricante. Lave as células uma vez e adicione 100 microlitros de meio fresco a cada uma.

Bem mate os poços de controle incubando em uma solução de metanol a 70% por 10 minutos antes de substituir por meio fresco. Adicione o reagente MTT a 10 microlitros por poço a cada poço da microplaca e incube durante a noite a 37 graus Celsius após a incubação durante a noite, solubilize a forma intracelular e os cristais com 100 microlitros da solução detergente fornecida. De acordo com o protocolo do fabricante, incubar as células na solução detergente por três horas à temperatura ambiente antes de obter os valores de absorbância.

Usando um leitor de microplacas para se preparar para a microscopia. Lave os fibroblastos duas vezes com solução salina saturada de fosfato estéril. Fixe as células por 10 minutos com metanol frio a 70% em pontos de tempo específicos após a dosagem de fibroblastos com lns.

Após 10 minutos, substitua o metanol por solução salina tamponada com fosfato ou PBS antes de capturar imagens usando um microscópio invertido. O S SLN sintetizado resultou em LNS de controle S com um diâmetro médio de partícula de 18,59 e com uma polidispersidade de 5,83 e SLMs carregados com vermelho do Nilo com um diâmetro médio de partícula de 16,87 nanômetros e com uma polidispersidade de 4,47 usando um ensaio MTT. O efeito da resposta à dose no metabolismo celular foi medido onde o aumento da concentração de partículas resultou em uma diminuição na viabilidade celular.

Não houve diferença observada na toxicidade entre as células expostas ao SLN sozinho versus carregado de vermelho do Nilo. SLN. Em células paralelas foram examinadas visualmente quanto à aderência à cultura de tecidos. Poliestireno e imagens foram tiradas para demonstrar a morfologia celular representativa e a absorção de partículas fluorescentes ao longo do tempo, usando uma dose igual a cinco microgramas por mililitro.

A absorção de partículas lipídicas foi observada duas horas após a exposição. O nível de incorporação de nanopartículas foi determinado medindo a intensidade da fluorescência do vermelho do Nilo em células dendríticas derivadas da medula óssea murina, ou B MDCs via citometria de fluxo. Foi observada uma correlação direta entre a concentração de SNS utilizada e a quantidade de fluorescência avaliada em MDCs B.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como sintetizar populações ultrapequenas de nanopartículas biocompatíveis, caracterizar suas propriedades físicas e investigar as interações das células de partículas.