Mapeamento óptica de Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca 2+ E Potencial Transmembrane no Coração Langendorff-perfundidos
10 de setembro de 2015
Este artigo descreve o protocolo detalhado e equipamentos necessários para o mapeamento de óptica dupla de transmembrana potencial (V m) e livre intra-retículo sarcoplasmático (RS) Ca2 + no coração de coelho Langendorff-perfundidos. Este método permite a observação direta e quantificação de V m e SR Ca2 + dinâmica no coração intacto.
O objetivo geral deste procedimento é mapear simultaneamente opticamente o retículo intrasarcoplasmático livre, o cálcio e o potencial transmembrana no coração de coelho perfundido com LOR isolado intacto. Isso é feito primeiro excisando o coração do coelho e canulando a aorta para perfusão retrógrada do lanor. O segundo passo é eliminar a contração adicionando um desacoplamento da contração de excitação ao perfu oito.
Em seguida, a perfusão é comutada para uma alça de recirculação de pequeno volume e um indicador de cálcio de baixa afinidade é adicionado à temperatura ambiente. As etapas finais são aquecer o coração a 37 graus Celsius usando o loop de profusão de grande volume e adicionar o corante sensível à voltagem. Assim, durante o experimento, as mudanças no cálcio e no potencial transmembrana são medidas excitando o coração com luz azul e medindo a luz emitida com câmeras CM OS de alta velocidade.
A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é que ela permite que os investigadores sondem diretamente o retículo sarcoplasmático ou SR para dinâmica curta de cálcio sem interferência de sinais de cálcio transmembrana. Este método também pode ajudar a responder a questões-chave relacionadas ao papel do manuseio de cálcio SR na contribuição para arritmias, porque o potencial transmembrana é registrado simultaneamente com o cálcio SR, geralmente os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque os sinais ópticos de cálcio SR são de amplitude muito baixa. Portanto, o carregamento adequado do indicador de cálcio é essencial Para este protocolo, é necessário ter à mão uma solução tyro recém-feita.
Quatro litros serão suficientes. Não misture as soluções-mãe concentradas sem diluição. Além disso, prepare as outras soluções com antecedência, conforme indicado no protocolo de texto, borbulhe o suprimento de tyros com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono e ajuste o fluxo de gás para definir o pH da solução muito próximo a 7,4.
A solução deve estar à temperatura ambiente. Prepare o sistema de perfusão L andorf recirculante colocando um filtro de nylon em linha com poros de 11 mícrons para filtrar o estado de perfusão. Agora prepare o sistema de profusão principal com cerca de dois litros de tyros oxigenados.
O volume total de dois litros inclui a solução no reservatório. Em seguida, prepare e prepare uma linha de profusão curta que contorne o reservatório da solução para criar um pequeno volume de recirculação de profusão para a gripe às cinco da manhã. O download do volume total no sistema de recirculação menor deve ser de cerca de 150 mililitros.
Para preparar o sistema de monitoramento de pressão, conecte um transdutor de pressão à linha de profusão e conecte a saída do transdutor a um amplificador de ponte de transmissão. Agora ligue o sistema de aquisição de dados. Configure-o para monitorar continuamente o ECG e a pressão de profusão.
Em seguida, ajuste a pressão de perfusão da linha de base para zero milímetros de mercúrio. Por fim, alinhe a câmera de mapeamento óptico conforme descrito no protocolo de texto. Para começar, prenda o coelho e anestesiá-lo com pentobarbital, juntamente com um bolus de 1000 unidades de heparina.
Cubra os olhos para acalmar o coelho. Comece com uma incisão na linha média para expor o esterno e as costelas usando uma tesoura de ponta romba. Corte o esterno entre o xifóide e o meibum.
Em seguida, abra cuidadosamente o esterno sem danificar o coração e abra as costelas para expor o coração. Em seguida, remova rapidamente todo o bloqueio coração-pulmão, cortando todos os vasos e tecidos circundantes. Transfira o bloco coração-pulmão para cerca de 100 mililitros de solução de tirano gelada.
No bloco de tecido excisado, localize a aorta e corte a aorta ascendente logo proximal aos três ramos do arco aórtico. Em seguida, canule a aorta com a cânula de oito calibres conectada ao sistema de profusão. Prenda a aorta à cânula com um pedaço de sutura de seda zero USP.
Depois de prender a cânula, disseque cuidadosamente a traqueia, os pulmões e a gordura epicárdica. Em seguida, identifique a válvula mitral e use cuidadosamente pinças afiadas e tesouras para danificar ou remover um folheto. Assim, a congestão da solução no ventrículo esquerdo não pode ocorrer.
Continue submergindo o coração na câmara de perfusão horizontalmente com o lado anterior para cima. Coloque a cânula em um pedaço de sardinha. Prenda a cânula com pinos em forma de U inseridos através do pedaço de sardinha e no fundo de silicone da placa de perfusão.
Isso impedirá que o coração se mova. Durante a imagem, um pequeno pino de inseto pode ser usado para estabilizar o ápice, se necessário, medir a quantidade de solução de tirano usada durante a canulação e substituí-la por uma solução nova para manter a solução circulante total em dois litros. Agora mergulhe totalmente os eletrodos de ECG no banho em ambos os lados do coração, mas não em contato com o coração.
Em seguida, verifique se isso torna uma morfologia normal de ECG de uma derivação. Enquanto isso, mantenha a pressão aórtica em 60 a 70 milímetros de mercúrio, ajustando o fluxo de perfusíveis entre 25 e 35 mililitros por minuto. Agora, desligue as luzes da sala e adicione 0,3 a 0,6 mililitros de solução estoque de estatina BLEs ao PERFU oito para uma concentração final de 10 a 20 micromolares.
Após 10 a 15 minutos, as contrações cardíacas devem parar. Em seguida, mude para o sistema de profusão de pequeno volume. Uma das chaves para o sucesso da imagem de cálcio SR é o carregamento adequado do corante de fluxo de cinco N am.
Isso requer uma perfusão de pequeno volume para atingir alta concentração de corante e condições de temperatura ambiente. Para evitar a esterificação D do D no citosol, Agora prepare 500 microlitros de solução de carga flu O five N am e misture-a com 500 microlitros de solução rodoviária. Em seguida, adicione-o ao PERFU oito.
Deixe o download prosseguir por 45 minutos e, em seguida, ligue o banho-maria circulante para aquecer o sistema a 37 graus Celsius. Após uma hora de download, volte para o volume maior do Perfu oito. Em seguida, misture 50 microlitros do corante sensível à voltagem RH 2 37 em um mililitro de tiros quentes.
Injete lentamente no sistema por cerca de cinco minutos e prossiga com o mapeamento óptico do coração. Para começar, focalize as câmeras de mapeamento óptico no campo apropriado para reduzir o movimento na superfície PERFU oito. Flutue uma lamínula sobre a solução.
Agora ajuste o feixe de luz LED para fornecer iluminação uniforme ao coração. Para cada gravação óptica, defina o protocolo de estimulação desejado. Acenda a luz de excitação e colete de um a quatro segundos de dados dentro de uma a duas horas.
O ruído do corante vazado colocará um fim ao experimento. Em seguida, lave o sistema com água deionizada. Em seguida, etanol 70% e finalize com outro enxágue de água deionizada.
Usando o protocolo descrito, a separação espectral do sinal do potencial transmembrana e do retículo sarcoplasmático ou sinal de cálcio SR pode ser separada. Traços ópticos durante a estimulação contínua também foram registrados. Os mapas de ativação foram então construídos a partir dos dados, traçando o tempo de ativação de cada pixel.
Em um gráfico isócrono, há um atraso típico de oito a 10 milissegundos entre os dois sinais. Foi possível quantificar a mudança relativa na RS diastólica. Carga de cálcio e amplitudes de liberação de cálcio SR sistólica em vários ciclos de estimulação. O manuseio patológico do cálcio SR foi observado após a aplicação do agonista do receptor beta adrenérgico isoproterenol.
As setas vermelhas apontam para um vazamento claro de cálcio do sr. Nessas condições, pode ocorrer o desencadeamento de potenciais de ação mediado por cálcio. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como realizar o mapeamento óptico simultâneo do potencial transmembrana e dos sinais de cálcio SR no coração de coelho Lang Endorf Perfused intacto.
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Visão Geral
Este artigo descreve um protocolo para mapeamento óptico duplo do potencial transmembranar e do cálcio livre no retículo sarcoplasmático em coração de coelho perfundido pelo método Langendorff. Este método permite a observação direta e a quantificação dessas dinâmicas no coração intacto.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Fisiologia Cardiovascular
- Técnicas de Imagem Óptica
Contexto
- Compreender a dinâmica cardíaca é fundamental para estudar a função cardíaca.
- O potencial transmembranar e os níveis de cálcio são indicadores-chave da saúde cardíaca.
- O mapeamento óptico fornece um método não invasivo para estudar esses parâmetros.
- A técnica de perfusão Langendorff permite estudos em coração isolado.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para mapeamento óptico simultâneo de V m e Ca 2+ do retículo sarcoplasmático.
- Aprimorar a compreensão da eletrofisiologia cardíaca.
- Fornecer um protocolo detalhado para pesquisadores da área.
Métodos Utilizados
- Ressecção do coração de coelho e cânulagem da aorta para perfusão retrógrada.
- Uso de um desacoplador da excitação-contração para eliminar a contração.
- Alteração para um circuito de perfusão recirculante com um indicador de cálcio de baixa afinidade.
- Aquecimento do coração e adição de um corante sensível à voltagem para mapeamento óptico.
Resultados Principais
- Medição simultânea bem-sucedida da V m e da dinâmica de Ca 2+ no RS.
- Demonstrou a eficácia da técnica de mapeamento óptico.
- Forneceram informações sobre a relação entre cálcio e potencial transmembranar.
- Estabeleceram um protocolo confiável para estudos futuros.
Conclusões
- A técnica de mapeamento óptico duplo é eficaz para estudar a dinâmica cardíaca.
- Este método pode avançar a pesquisa em fisiologia cardíaca.
- Aplicações futuras podem incluir estudos sobre doenças cardíacas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a medição direta e simultânea do cálcio intra-retículo sarcoplasmático e do potencial transmembranar em tecido cardíaco intacto, fornecendo subsídios mecanicistas sobre o acoplamento excitação-contração e substratos arritmogênicos. Ao elucidar a dinâmica espacial e temporal do manuseio de Ca2+ no retículo sarcoplasmático em um modelo fisiologicamente relevante, ele auxilia na validação de alvos terapêuticos e na redução de riscos no descobrimento de fármacos cardiovasculares. A abordagem integra mecanismos moleculares com fenótipos em nível tecidual, aumentando a confiabilidade preditiva das avaliações pré-clínicas de segurança e eficácia.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas mediante a quantificação da carga e da dinâmica de liberação de Ca2+ no retículo sarcoplasmático sob estresse fisiopatológico, como a estimulação beta-adrenérgica.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos envolvidos no manejo de cálcio, reduzindo a ambiguidade mecanicista na seleção inicial de alvos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados com capacidade de dupla leitura para avaliar os efeitos de compostos tanto na eletrofisiologia quanto na homeostase de cálcio.
- Valor Operacional: Apoia a padronização de ensaios por meio do monitoramento simultâneo de Vm e Ca2+ no retículo sarcoplasmático, melhorando a reprodutibilidade na triagem de canais iônicos e moduladores de cálcio.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona perturbações moleculares a fenótipos arritmogênicos em nível tecidual, permitindo a modelagem de sistemas relevantes para doenças e a alinhamento de biomarcadores translacionais.
- Valor Operacional: Facilita decisões de avanço ajustadas ao risco mediante a identificação precoce de sinais pró-arrítmicos na avaliação pré-clínica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a otimização do composto líder e o perfil de segurança pré-clínico, especialmente para compostos que afetam canais iônicos cardíacos ou proteínas reguladoras de cálcio.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao revelar relações bidirecionais entre Vm e Ca2+ no retículo sarcoplasmático (SR) sob estimulação rítmica e desafio farmacológico.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios e saídas quantitativas que permitem comparar compostos testados com condições controle em formato padronizado.
- Análises: Fornece medições espaciais e temporais de alta resolução dos transientes de cálcio e da dinâmica do potencial de ação, permitindo análise comparativa entre grupos experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas à continuidade pré-clínica ao modelar substratos arritmogênicos observados em estados patológicos.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável para farmacologia de segurança cardíaca e estudos de mecanismo de ação em múltiplos projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da observação direta do manuseio de Ca2+ no retículo sarcoplasmático e suas consequências eletrofisiológicas.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade por meio do mapeamento óptico de dois parâmetros em um sistema perfundido Langendorff controlado.
- Valor Estratégico: Tomada de decisões aprimorada sobre avanço ou interrupção do desenvolvimento ao detectar gatilhos arritmogênicos mediados por cálcio antes de falhas tardias e onerosas.
- Impacto na Carteira: Priorização ajustada ao risco de compostos com base em seus efeitos na estabilidade do cálcio no retículo sarcoplasmático e na estabilidade transmembrânica.
Considerações sobre a Implementação
- É necessária experiência em mapeamento óptico, técnicas de perfusão e manuseio de corantes fluorescentes para a aquisição bem-sucedida do sinal.
- A instrumentação inclui câmeras CMOS de alta velocidade, sistemas de excitação com LED e configurações de perfusão capazes de operar em modo de recirculação e de grande volume.
- A padronização entre equipes depende de uma carga consistente de corante, controle de temperatura e protocolos de estimulação uniformes entre laboratórios.
- A adaptação a outros sistemas modelo (por exemplo, tecido de rato ou humano) pode exigir a otimização da concentração do indicador e dos parâmetros de perfusão.
- As limitações práticas incluem a baixa amplitude do sinal dos indicadores de cálcio do retículo sarcoplasmático, o que exige um cuidadoso carregamento com corante e a minimização da interferência citosólica.
