Entrega de proteínas, peptídeos ou célula-impermeável Pequenas moléculas em células vivas por incubação com o Endosomolytic Reagente dfTAT

O objetivo geral do experimento a seguir é entregar macromoléculas em células vivas usando dímero, tat fluorescente ou df tat, um reagente que pode penetrar nas células com muita eficiência sem danificá-las. Isso é conseguido primeiro gerando e purificando o agente de entrega. Dfta como um segundo passo.

Dfta é incubado com células por uma hora a 37 graus Celsius na presença da carga de macromolécula de interesse, df tat induz a captação da carga dentro de vesículas endocíticas. As vesículas amadurecem em endossomos iniciais, finalmente atingindo o estágio final do endossomo, onde DF tat é capaz de liberar a carga no espaço citosólico das células. Em seguida, as células são visualizadas por microscopia de fluorescência para avaliar a eficiência de entrega do detta e da carga de interesse.

Os resultados mostram que DF TT pode entrar nas células com alta eficiência e sem citotoxicidade observável. A principal vantagem dessa técnica sobre as abordagens de entrega sólida existentes é que nosso agente de entrega tem uma alta eficiência de entrega sem impacto negativo observável na fisiologia celular. Além disso, é fácil de usar, pois requer apenas uma simples etapa de co-incubação.

Para começar, a síntese FTA incha 500 miligramas de R amida, resina MBHA e dimetilformamida ou DMF em um recipiente SPPS padrão de 50 mililitros por uma hora para realizar a reação em temperatura ambiente usando gás nitrogênio apenas o suficiente para borbulhar a reação. Sintetize FTA na resina MBHA de amida da pista usando 1,2 milimoles de cada aminoácido protegido por FM listado no protocolo de texto para cada reação de acoplamento de aminoácidos. Adicione também o ponto 44 gramas de HBTU e o ponto 51 mililitros de DIEA dissolvido em DMF para realizar cada reação de acoplamento de aminoácidos por quatro horas após o acoplamento de quatro horas.

Lave a resina com DMF e execute a etapa de proteção FD conforme descrito no protocolo de texto. Repita até que a cadeia peptídica linear do FTA seja sintetizada. Em seguida, Cleve o grupo protetor MTT incubando a resina com 20 mililitros de uma solução composta de ácido acético 1% trifluor ou TFA e 2% tri isopropil cy ou TIS em DCM por cinco minutos.

Como a remoção do grupo protetor MTT resultaria no aparecimento de uma cor amarela. Repita isso até que nenhuma cor amarela seja observada lavando a resina com DCM e DMF no meio. Adicione uma solução adicional com 1% de TFA em DCM à resina para garantir que nenhum MTT seja removido e a solução permaneça transparente.

Em seguida, dissolva T-M-R-H-B-T-U e DIEA em DMF e adicione esta mistura à resina. Efectuar a reacção durante a noite com azoto seco para proporcionar agitação após a protecção fm d e a conjugação de aminoácidos. Lave a resina com DCM e deixe-a secar para uma clivagem completa do peptídeo da resina.

Adicione uma solução contendo 92,5% de TFA, 2,5% de água, 2,5% de TIS e 2,5% de etano di tiol à resina peptidil por três horas em temperatura ambiente para obter proteção profunda global e clivagem da resina. Precipitar os produtos peptídicos brutos usando éter etílico anidro frio, drenando a solução preparada em 40 mililitros de éter eyl. Gire isso a quatro graus Celsius e 4.000 G por 20 a 25 minutos.

Repetir este passo para permitir a lavagem do precipitado com éter etílico anidro frio reus. Suspenda os precipitados em água e liofilize, em seguida, ressuspenda os produtos obtidos no teste de ACEDONITA TFA aquosa a 0,1%. Realize cromatografia líquida de alta eficiência ou análise de HPLC com uma coluna analítica C 18.

Para analisar cada peptídeo, use uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto e detecção em 214 nanômetros e 550 nanômetros. Em seguida, execute HPLC semi-preparativa em uma coluna C 18 para purificação de peptídeos. Use uma taxa de fluxo de quatro mililitros por minuto e detecção em 214 nanômetros e 550 nanômetros para todas as execuções.

Use gradientes lineares antes de realizar a reação de oxidação. Confirme a identidade correta dos peptídeos por MALDI de acordo com o protocolo do fabricante. Dissolva o FTA em solução salina tamponada com fosfato aerado.

Certifique-se de que o pH esteja entre 7,0 e 7,5. Após a adição do peptídeo, mute a reação durante a noite para permitir que ela reaja até a conclusão. Purificar o produto usando HPLC de fase reversa e analisar por espectrometria de massa como antes, liofilizar o DF puro e suspender em 200 microlitros de água para medir a concentração.

Resus suspende uma alíquota da tat DF purificada em 149 microlitros de solução TCEP de 50 milimolares para permitir que a amostra reaja por aproximadamente 20 minutos. Nesta etapa, o DF tat é reduzido ao seu monômero F tat para eliminar a extinção da absorbância que ocorre devido à proximidade do TMR piso quatro e DF tat. Adicione todas as soluções a um CVE de quartzo e meça a absorbância em 556 nanômetros.

Usando a lei da cerveja. Determinar a concentração da solução. Isso corresponde à concentração de fta.

Divida a concentração de FTA por dois para obter a concentração de dfta. Cultive as células em um meio apropriado até 80 a 90% de fluência de Conf em uma atmosfera umidificada de 37 graus Celsius contendo 5% de CO2, lave as células três vezes com 200 microlitros de PBS e uma vez com NRL 15. Incube as células com cinco micromolares com ou sem carga, como proteína fluorescente verde aprimorada e mantenha a 37 graus Celsius por uma hora para induzir vazamento endossômico após a incubação.

Lave as células três vezes com heparina em meio L 15 para remover a tat DF ligada à membrana plasmática das células. Como uma imagem da etapa final, as células usando um microscópio de fluorescência imagem DF tat usando uma proteína fluorescente vermelha ou filtro RFP para avaliar a diferença entre F TAT e D ftt. As células heela são incubadas com cada peptídeo para determinar a diferença em sua localização celular.

Como mostrado aqui, o FTA localiza em uma distribuição pontilhada. Essa distribuição é consistente com o peptídeo que permanece aprisionado dentro dos endossomos. Em contraste, o sinal fluorescente do dfta exibe uma distribuição homogênea em todo o citosol e núcleo.

A distribuição citosólica do DF tat é observada em várias linhagens celulares diferentes. As imagens de 20 x mostram que uma porcentagem muito alta em um prato exibe uma distribuição citosólica de DF tat sem toxicidade celular, como visto por nenhuma coloração nuclear azul de citação, para determinar se o vazamento endossômico mediado por dfta fornece proteínas grandes no citosol das células. O EGFP foi usado para detectar a entrega de proteína dobrada corretamente.

O EGFP exibiu uma distribuição fluorescente verde citosólica e nuclear, semelhante ao observado para DF tat em mais de 90% das células sem toxicidade observável Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que as células não devem ser excessivamente confluentes. Além disso, as células devem ser bem lavadas para remover o FPS antes de adicionar df tap.