Membrana de imagem Potencial com dois tipos de sensores de tensão fluorescentes geneticamente codificados
4 de fevereiro de 2016
Um método para imagens de alterações no potencial de membrana usando indicadores de tensão geneticamente codificados é descrito.
O objetivo geral deste procedimento é relatar opticamente as mudanças de potencial da membrana com um indicador de tensão codificado geneticamente. Este método descreverá os pontos fortes e fracos da imagem com diferentes sondas fluorescentes de voltagem geneticamente codificadas. Por exemplo, as sondas baseadas em FRET oferecerão a vantagem da imagem raciométrica, mas fornecerão um sinal mais baixo.
A principal vantagem dessa técnica é que podemos visualizar a atividade neural em tempo real. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a relação sinal-ruído não é muito grande e existem várias fontes de ruído e várias etapas que podem dar errado. Novos usuários costumam ficar confusos e a interferência é considerada como um sinal real.
A demonstração visual desse método é fundamental para verificar a validade das sondas que estão sendo usadas e o que ela realmente indica. Para a configuração, um divisor de imagem é instalado entre as câmeras CCD lentas e rápidas para a imagem de GEVI baseada em FRET. Antes do experimento, insira um cubo de filtro com um espelho dicróico e dois filtros de emissão no divisor de imagem.
Remova este segundo cubo de filtro ao obter imagens de um GEVI com uma única proteína fluorescente. Para iniciar o experimento, localize uma célula HEK293 saudável que mostre uma fluorescência de membrana forte e localizada em comparação com a fluorescência interna e evite remendar células circulares enquanto elas estão se dividindo ou morrendo. Em seguida, aplique um pulso de teste para verificar a resposta atual.
Depois, abaixe a pipeta de grampo de remendo logo acima da superfície da célula. Em seguida, abaixe lentamente a pipeta até que ela toque suavemente a membrana celular. A resistência da membrana deve aumentar para um a dois megaohm.
Depois disso, estabeleça uma vedação de gigaohm aplicando suavemente pressão negativa através da pipeta. Assim que uma vedação de gigaohm for alcançada, defina o potencial da pipeta em um potencial de retenção desejado. Em seguida, foque a câmera CCD de alta velocidade no corpo da célula.
Para a gravação GEVI baseada em FRET, ajuste o tamanho das imagens divididas para resultar em uma visualização uniformemente espaçada para cada comprimento de onda de emissão usando os botões no divisor de imagem. Em seguida, rompa a membrana celular aplicando pressão negativa para formar toda a configuração celular. Agora, abra o software de imagem.
Em seguida, clique no menu adquirir câmera SciMeasure para abrir a página de aquisição do CCD. Em seguida, crie um novo arquivo de dados para salvar a gravação. Clique na saída analógica e leia um ASCII para abrir um protocolo de pulso file para realizar a imagem.
Em seguida, clique na média das repetições internas para calcular a média do número de tentativas. Em seguida, feche a página de saída analógica. Defina os parâmetros de aquisição específicos na página de aquisição do CCD.
Depois disso, insira os valores específicos para o número de quadros para aquisição e o número de tentativas. Em seguida, clique no botão obter óptica de dados mais BNC para iniciar a gravação. Enquanto a imagem de tensão está ocorrendo, monitore o osciloscópio para garantir uma configuração estável de toda a célula durante toda a gravação.
Para calcular a alteração de fluorescência fracionária, clique em arquivo e, em seguida, leia o arquivo de dados para abrir um arquivo de dados que foi gravado na etapa anterior. A imagem da célula em sua intensidade de luz em repouso deve ser vista no lado direito. Em seguida, clique em mostrar BNCs para mostrar os valores atuais da tensão final.
Altere o modo de página de quadro RLI para subtração de quadro para utilizar a função de subtração de quadro para identificar os pixels com sinais ópticos responsivos. Em seguida, selecione dois pontos de tempo para subtração e identifique a área celular que mostra sinais em resposta à mudança de potencial de membrana. Em seguida, designe os pixels que precisam ser analisados arrastando ou clicando em cada pixel.
A representação gráfica da intensidade média de fluorescência dos pixels selecionados deve aparecer no lado esquerdo da janela do software. Divida os pixels subtraídos com a intensidade da luz em repouso clicando em dividir pelo botão do RLI para adquirir os valores de alteração de fluorescência fracionária. Para exportar os dados, remova os gráficos de tensão final atual desmarcando mostrar menu do BNC.
Vá para saída, salve traços como ASCII exibido para exportar o traço de fluorescência em um formato de arquivo ASCII para a análise de ajuste de curva. Neste procedimento, desenhe o gráfico de mudança de fluorescência versus tensão plotando as mudanças de fluorescência fracionária em resposta à tensão em um programa de análise de dados. Depois disso, ajuste a curva a uma função de Boltzmann para determinar a faixa de tensão do sinal óptico clicando em análise, ajuste, ajuste sigmoidal e abra a caixa de diálogo.
Replote as alterações de fluorescência fracionária normalizadas em resposta à tensão usando o programa de análise de dados. Para calcular a velocidade da resposta óptica, abra o arquivo ASCII e plote o traço de mudança de fluorescência fracionária em relação ao tempo. Em seguida, clique no seletor de dados no software de análise de dados e selecione um ponto de tempo correspondente ao início de um pulso de tensão escalonado e um segundo ponto de tempo onde o sinal óptico atingiu o estado estacionário.
Ajuste esse intervalo a uma função de decaimento exponencial simples e duplo clicando em análise, ajuste, ajuste exponencial, abra a caixa de diálogo e relate o melhor ajuste. Esta figura mostra a mudança de fluorescência de uma célula HEK expressando um único GEVI Bongwoori baseado em FP. Esta é uma mudança típica de fluorescência em resposta aos pulsos de tensão escalonados.
Aqui, uma célula HEK293 foi fotografada com uma câmera CCD de alta velocidade. Esta imagem mostra a intensidade da luz em repouso de uma célula expressando Bongwoori. E esta é uma imagem de subtração de quadro indicando os pixels onde a mudança de fluorescência foi observada.
Aqui é mostrado o registro óptico dos potenciais de ação induzidos dos neurônios primários do hipocampo do camundongo que expressam Bongwoori. Os potenciais de ação foram evocados sob o modo de pinça de correntes de célula inteira. O traço de mudança de fluorescência fracionada foi selecionado a partir dos pixels correlacionados ao soma.
Nesta figura, a mudança de fluorescência de uma célula HEK expressando GEVI baseada em FRET mostra as respostas aos pulsos de tensão escalonados em dois comprimentos de onda. Gravado a um kilohertz com uma câmera CCD de alta velocidade. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de testar os níveis variáveis de fluorescência, pois a superexpressão de fluorescência pode afetar a saúde da célula.
Seguindo este procedimento, outros métodos, como codificações de fatiador, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais envolvendo a atividade dos neurônios de vários circuitos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter imagens do potencial de membrana usando diferentes tipos de sonda.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método para a obtenção de imagens de alterações no potencial da membrana utilizando indicadores genéticos de voltagem. A técnica permite a visualização em tempo real da atividade neural, embora apresente desafios para novos usuários devido a problemas de ruído e interpretação do sinal.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Eletrfisiologia
- Técnicas de Imagem
Contexto
- Indicadores genéticos de voltagem são utilizados para monitorar alterações no potencial da membrana.
- Diferentes sondas fluorescentes apresentam forças e fraquezas variadas.
- Sondas baseadas em FRET permitem imagens ratiométricas, mas podem produzir sinais mais baixos.
- Compreender a relação sinal-ruído é essencial para uma interpretação precisa.
Objetivo do Estudo
- Para relatar opticalmente alterações no potencial da membrana.
- Para avaliar a eficácia de diversas sondas fluorescentes codificadas geneticamente.
- Para fornecer insights sobre a visualização em tempo real da atividade neural.
Métodos Utilizados
- Utilização de indicadores de voltagem codificados geneticamente.
- Comparação de diferentes técnicas de imagem.
- Análise das relações sinal-ruído.
- Avaliação dos desafios enfrentados pelos usuários na interpretação de sinais.
Resultados Principais
- A visualização em tempo real da atividade neural é viável.
- As sondas baseadas em FRET oferecem vantagens apesar dos sinais mais fracos.
- Novos usuários enfrentam dificuldades devido à interferência de ruídos.
- Um treinamento adequado é essencial para distinguir sinais reais de ruídos.
Conclusões
- Os indicadores genéticos de voltagem são valiosos para a pesquisa em neurociência.
- Compreender as limitações de diferentes sondas é essencial.
- Treinamento e experiência podem melhorar a interpretação do sinal.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem do potencial de membrana com indicadores genéticos de voltagem (GEVIs) permite a visualização em tempo real da eletrofisiologia celular, apoiando a validação precoce de alvos na descoberta de fármacos em neurociência. O método fornece leituras quantitativas e dinâmicas da atividade neuronal, auxiliando na redução de riscos mecanicistas ao associar os efeitos de compostos a alterações funcionais no potencial de membrana. Essa capacidade melhora a confiança preditiva na identificação de fármacos líderes ao oferecer um relato óptico direto do engajamento do alvo em células vivas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da detecção óptica da dinâmica do potencial de membrana em resposta à modulação farmacológica.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos por meio da medição direta e em tempo real de alterações de voltagem em células vivas que expressam GEVIs.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança no engajamento do alvo ao fornecer leituras de fluorescência ratiométricas ou baseadas em intensidade, correlacionadas a mudanças de voltagem.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do ensaio: Facilita a preparação de sistemas celulares validados (por exemplo, HEK293) para triagem de compostos em etapas subsequentes mediante expressão estável de GEVIs e integração com o método de patch clamp em célula inteira.
- Saída quantitativa: Permite a aquisição de imagens por razão com GEVIs baseados em FRET, melhorando a confiabilidade do sinal e reduzindo artefatos decorrentes da variabilidade de expressão ou fotodegradação.
- Escalabilidade: Compatível com aquisição rápida por CCD e protocolos de pulso automatizados, permitindo ensaios repetidos e análise de resposta à dose.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Aplicável a modelos neuronais (por exemplo, neurônios primários do hipocampo) para avaliar os efeitos de compostos em contextos eletrofisiológicos relevantes para doenças.
- Continuidade Translacional: Conecta achados in vitro ao potencial in vivo, estabelecendo a competência em imagem individual de células como pré-requisito para estudos em tecidos complexos.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite discriminar efeitos de voltagem específicos do composto de ruídos inespecíficos por meio da subtração de quadros e normalização da linha de base.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a investigação inicial do alvo até a otimização do composto líder, onde leituras funcionais de voltagem orientam a seleção de compostos antes dos testes de eficácia pré-clínicos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a correlação de sinais ópticos com estímulos de fixação de voltagem para validar a resposta da sonda e a saúde celular.
- Triagem: Fornece medições prontas para ensaios e reprodutíveis por meio de configuração padronizada de célula inteira e normalização do fundo de fluorescência.
- Análises: Oferece análise cinética e da variação fracional da fluorescência (ajuste exponencial) para quantificar a amplitude do sinal e a velocidade de resposta.
- Pesquisa Translacional: Permite a transição de modelos de células únicas HEK293 para neurônios primários, apoiando a avaliação da relevância translacional.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de imagem reutilizável para estudos de modulação de canais iônicos em diversas classes de alvos e campanhas de triagem.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao fornecer um relato óptico direto e em tempo real das alterações no potencial de membrana como biomarcador funcional da atividade neuronal.
- Valor Operacional: Promove a padronização por meio de protocolos definidos de patch clamp, calibração do divisor de imagem e etapas padronizadas de análise (subtração de quadros, normalização do RLI).
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção ao permitir a detecção precoce de efeitos eletrofisiológicos inespecíficos, reduzindo o risco de falhas em estágios avançados.
- Impacto sobre o Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao quantificar deslocamentos de tensão induzidos por compostos com limiares definidos para avanço.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em eletrofisiologia (patch clamp em célula inteira), microscopia de fluorescência e manipulação de GEVI.
- Depende de câmeras CCD de alta velocidade, divisores de imagem e cubos de filtros para detecção de FRET em duplo comprimento de onda.
- Necessita padronização entre equipes distintas, de imagem e de eletrofisiologia, para aquisição consistente de dados.
- Considerações para adaptação incluem o tipo de GEVI (proteína fluorescente única versus baseado em FRET), níveis de expressão e adequação da linhagem celular (por exemplo, evitar células HEK293 em divisão ou morrendo).
- Limitações práticas incluem baixa relação sinal-ruído, susceptibilidade a artefatos por superexpressão e interpretação dependente do usuário entre sinais ópticos e ruído.
