Through the Looking Glass: Microscopia Time-lapse e Longitudinal de rastreamento de células individuais para estudar Therapeutics Anti-câncer

O objetivo geral deste procedimento é observar a resposta terapêutica anticancerígena em células únicas em cultura. Este método pode responder a questões-chave no campo de pesquisa do câncer, incluindo resposta terapêutica heterogênea e destino celular. Para começar, sob uma capela de fluxo laminar estéril certificada, prepare as células HT1080 em placas certificadas para cultura de acordo com o protocolo de texto e incube as células em uma incubadora de cultura de células umidificada.

Dois dias antes da imagem, coloque 50.000 células HT1080 FuGENE por poço no número desejado de poços de um prato de fundo de vidro nº 1,5 de 12 poços. Ajustar o número de células plaqueadas em função da sua taxa de crescimento e da placa utilizada, de modo a atingir aproximadamente 60% de confluência para o início da experiência.

Configure a câmara ambiental para aproximadamente 80% de umidade com a temperatura na posição da amostra ajustada em 37 graus Celsius. Certifique-se de que o reservatório de água esteja cheio de água destilada estéril seguindo as instruções do fabricante. Em seguida, ligue a câmara ambiental para a configuração de temperatura desejada e posicione-a no microscópio stage e ajuste.

Se houver algum espaço livre entre a câmara superior do palco e a inserção do palco, coloque pedaços de filme de parafina sobre as bordas da abertura de inserção do palco, antes de inserir a câmara nela, para acoplar a câmara ao palco. Certifique-se de que nenhuma conexão esteja puxando a câmara, o que pode introduzir artefatos de movimento. Insira uma travessa fictícia com água na câmara e deixe a câmara se equilibrar a 37 graus Celsius e mantenha uma temperatura estável.

Para configurar a geração de imagens, ligue o microscópio, o computador e todos os periféricos necessários. Dependendo da fonte de luz, espere para ligá-lo até que seja necessário. Com a torre da objetiva em uma posição baixa, selecione a objetiva de abertura numérica de 20x 0,7.

Em seguida, posicione a amostra sobre a objetiva, o que facilitará a localização das células quando a amostra estiver na câmara. Depois de transferir as células a serem visualizadas para a câmara ambiental, de acordo com o protocolo de texto, sele a câmara para manter um ambiente estável e ligue o gás atmosférico. Em seguida, selecione as condições de imagem que evitarão a fototoxicidade, limitando os tempos de exposição e usando luz de baixa intensidade.

Para encontrar os planos X, Y e Z e os comprimentos de onda desejados para cada posição a ser fotografada. Para lapso de tempo de longo prazo da maioria dos processos celulares, adquira uma imagem a cada dez a vinte minutos. Maior resolução de tempo fornece mais pontos de dados e rastreamento de células mais robusto, mas resulta em exposição à luz mais integrada e conjuntos de dados maiores.

Como o HT1080 FuGENE possui proteínas florescentes verdes e vermelhas dinâmicas, use os seguintes tempos de exposição e use um silo dois por dois. Em configurações avançadas, ative o foco automático controlado por software usando as configurações padrão. Defina um intervalo de foco automático de 10 micrômetros com o tamanho de passo recomendado.

No prato experimental, para reduzir a deriva térmica, substitua metade do meio por meio contendo o medicamento desejado que foi aquecido a 37 graus Celsius. Por fim, inicie o lapso de tempo e adquira imagens de acordo com o protocolo de texto. Esses filmes mostram exemplos de um par de linhagens celulares MCF7 derivadas de câncer de mama que diferem apenas em seu status de p53 que foram tratadas com uma droga anticâncer que inibe a cinesina-5, resultando em parada mitótica.

Como visto nesta figura, quando o p53 é removido por knockdown estável do p53, em vez de parar depois de deixar a mitose, as células passam por ciclos repetidos onde entram em uma segunda rodada de mitose em vez de parar e deixam a mitose sem divisão. Aqui são mostradas células Hela derivadas do carcinoma cervical expressando de forma estável o marcador de cromatina Histona 2b fundida a mCherry e tubulina beta fundida a EGFP. Quando tratado com a droga estabilizadora de microtúbulos paclitaxol, o alinhamento e a segregação cromossômica são interrompidos durante a mitose, resultando na formação de protuberâncias nucleares e micronúcleos que são propensos a danos no DNA.

Esta linha celular coexpressa de forma estável os dois indicadores do ciclo celular da ubiquitina florescente para CDT1, em laranja, e geminina em verde, e progride ao longo do ciclo celular normalmente. Quando as mesmas células são tratadas com o inibidor de CDK46, as células progridem através da fase G2 e se dividem normalmente e depois param fortemente na fase G1, indicando o potencial de efeitos citostáticos afetivos em tumores em crescimento. A principal vantagem dessa técnica é que você pode acompanhar uma única resposta celular, diretamente, em tempo real ao longo de muitos dias, em vez de inferir essas respostas.