A desnervação cirúrgica cutânea: um método para testar o requisito para os nervos no mouse modelos de doença de pele

O objetivo geral deste procedimento é examinar a influência dos nervos sobre a pele normal e patológica. Este método pode ser usado para responder perguntas fundamentais na biologia da pele normal, como por exemplo se os nervos cutâneos afetam a homeostase e doenças. A principal vantagem desta técnica é que permite comparar amostras de pele intacta e desservada provenientes do mesmo animal.

A demonstração visual desta técnica é fundamental, pois os nervos podem ser difíceis de reconhecer e remover com danos mínimos aos tecidos circundantes. Primeiro, anestesie o camundongo e verifique se ele atingiu o plano adequado de sedação utilizando um aperto no dedo do pé. Além disso, confirme que o camundongo apresenta respiração e batimento cardíaco normais.

Agora, coloque o animal sobre uma placa aquecida em uma área cirúrgica asséptica. Com uma tesoura elétrica, remova cuidadosamente os pelos no lado dorsal onde será realizada a biópsia. Em seguida, limpe a área depilada utilizando compressas de Betadyne e álcool.

Certifique-se de que todos os cortes de cabelo sejam removidos do local. Agora, delimite o local da biópsia usando uma caneta preta. Para obter cortes longitudinais dos folículos pilosos, a borda mais longa da biópsia deve seguir na direção anterior a posterior parassetal à linha média dorsal.

Usando um bisturi, faça uma excisão de espessura total sem danificar a fáscia muscular subjacente. O sangramento é tipicamente mínimo. A amostra da biópsia deve incluir a epiderme, a derme, a gordura subcutânea e o pânico carnoso.

Achate a amostra de pele ressecada sobre uma toalha de papel seca, com o lado da derme voltado para baixo. Remova o excesso de toalha de papel e armazene a amostra em TBS frio por até uma hora, caso seja necessário coletar outras amostras. Retornando ao camundongo, feche o local da biópsia com pontos de nylon nº 60 espaçados cerca de três milímetros entre si.

Em seguida, monitore o camundongo em uma gaiola de recuperação até que ele recupere a consciência. Utilize analgésicos de acordo com os cuidados institucionais designados para animais e siga as orientações institucionais se o camundongo apresentar sinais de sofrimento. Entre sete e dez dias após a cirurgia, remova os pontos.

Prossiga com o processamento das biópsias para histologia ou coloração em montagem inteira. Anestesie o animal, retire os pelos de toda a pele dorsal e limpe a área de maneira semelhante ao procedimento de biópsia. Em seguida, faça uma incisão usando um bisturi estéril ao longo da linha média dorsal, desde a base do pescoço até aproximadamente meio centímetro acima da cauda.

Usando pinças rombas estéreis, retrair suavemente a pele no lado esquerdo para longe da região lombar para visualizar o tecido subjacente desde os acúmulos de gordura escapulares próximos ao pescoço até logo acima do membro traseiro. Agora, identificar o nervo cutâneo dorsal sob um microscópio estereoscópico. Estes aparecem como fileiras brancas que se estendem caudalmente através da fáscia translúcida da parede do tronco antes de fazerem curvas acentuadas e penetrarem no tecido conjuntivo frouxo situado abaixo da pele.

Em seguida, utilizando pinças ultrafinas, remova o nervo exclusivamente do lado esquerdo do animal localizado nos sítios anatômicos T3 a T12, puxando-os a partir dos pontos onde seus segmentos se dobram na parede do tronco até seus pontos de entrada na pele. Oriente as pinças verticalmente e segure os nervos cerca de meio centímetro abaixo dos pontos de dobramento. Uma vez seguros, puxe para cima para esticar os nervos e separá-los do tecido circundante, removendo-os.

Evite danificar os vasos sanguíneos adjacentes. Certifique-se de manter o tecido úmido durante todo o procedimento, aplicando periodicamente gotas de solução salina 0,9%. Continue removendo todos os nervos que se estendem da parede do tronco até a pele, mas não perturbe os nervos dentro da fáscia densa da parede do tronco.

Em seguida, remova os nervos da aba de pele exposta. Essas fibras compreendem os ramos distais do nervo cutâneo dorsal e aparecem como filamentos brancos ramificados localizados esporadicamente no tecido conjuntivo do lado dérmico da aba de pele. Para remover esses ramos finos, posicione a pinça aproximadamente paralela à superfície dérmica, segure o nervo e puxe para cima.

Remova todos os nervos visíveis dessa maneira. Não perfure os vasos sanguíneos nem a pele. Durante este passo, é importante evitar romper os vasos sanguíneos vizinhos.

Se encontrar um nervo com um vaso sanguíneo adjacente, siga-o até uma região onde não haja vaso adjacente e remova-o por pinçamento. Agora, solte a pele no lado direito da incisão na linha média dorsal, mas não remova nenhum nervo. Isso servirá como controle operatório simulado contralateral.

Por fim, feche cirurgicamente o animal e realize o monitoramento pós-operatório como antes. Posteriormente, para confirmar a perda estável dos nervos, semanas após a cirurgia, fure suavemente a área desnervada usando uma agulha hipodérmica estéril. Observe se o animal responde, normalmente tremendo ou virando a cabeça.

Se a área da pele tiver sido desnervada de forma estável, o animal apresentará pouca ou nenhuma resposta. Colete biópsias de pele da área sem resposta e do lado contralateral submetido a procedimento simulado para obter amostras pareadas experimentais e controle. Das biópsias, é importante analisar múltiplas seções histológicas para identificar possíveis diferenças na abundância ou na morfologia dos domos táteis entre os espécimes controle e desnervados.

A linhagem de camundongos glebe one cree ERT2 permite direcionar a recombinação genética induzida por tamoxifeno a áreas da pele que exibem alta atividade da via hedgehog, como os epitélios dos domos táteis. Esses camundongos foram cruzados com camundongos repórter abolaxi para visualizar os epitélios dos domos táteis. Os nódulos são cruciais para manter tanto os domos táteis normais quanto as células de Merkel associadas.

Isso é demonstrado experimentalmente pela perda gradual da morfologia normal da cúpula tátil, bem como pela perda de células depositadas de queratina oito após a desnervação. Os nervos também são cruciais para promover a sinalização hedgehog na cúpula tátil, conforme monitorado pelas expressões Glebe one cree ERE2 e pela coloração de corte coletivo beta em lâmina de pele intacta e desnervada. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como ablar cirurgicamente os nervos cutâneos dorsais para testar se esses nervos estão envolvidos na função normal da pele ou se eles modulam doenças.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada rotineiramente e com confiabilidade, causando estresse mínimo ao animal. Após este procedimento, métodos como a coloração fluorescente amino podem ser utilizados para confirmar se os nervos foram completamente ablados da pele e se a expressão gênica está sendo afetada.