Gap juncional intercelular comunicação: um biomarcador funcional para avaliar os efeitos adversos de tóxicos e toxinas, e Benefícios para a saúde de produtos naturais
25 de dezembro de 2016
Este protocolo descreve uma técnica de transferência de bisturi de carga e corante fluorescente que mede comunicação intercelular através dos canais de junções de hiato. Gap comunicação intercelular juncional é um importante processo celular pelo qual a homeostase do tecido é mantido e ruptura dessa sinalização celular tem efeitos adversos para a saúde.
O objetivo geral é fornecer um ensaio simples para medir a comunicação intercelular juncional através de uma população de células de mamíferos que pode atender a uma ampla gama de necessidades farmacológicas e toxicológicas in vitro. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da toxicologia, como se um composto afeta o desenvolvimento ou a manutenção de um tecido, desregulando a comunicação intercelular da junção comunicante. A principal vantagem dessa técnica é que ela oferece uma avaliação simples e rápida da função da junção comunicante em uma grande população de células em resposta a tóxicos e toxinas.
Demonstrando o procedimento estará Ajna Uzuni, assistente de pesquisa de graduação do meu laboratório. Para iniciar o experimento, semeie três vezes 10 elevado ao quinto WB-F344 células epiteliais do fígado de rato em placas de cultura de 35 milímetros de diâmetro contendo meio modificado de Eagle mais 5% de soro fetal-bovino. Cultive as células em uma incubadora até atingirem 100% de confluência e continue com o tratamento experimental das células.
Para continuar com os experimentos de dose-resposta, adicione 10 microlitros e 20 microlitros de uma solução estoque de dois milimolares previamente preparada de fenantreno em 100% de acetonitrila e quatro microlitros, seis microlitros e oito microlitros de uma solução estoque de 20 milimolares de fenantreno em 100% de acetonitrila a três placas de células contendo dois mililitros de meio de crescimento para cada volume adicionado de solução estoque. Em seguida, adicione quatro microlitros, seis microlitros, oito microlitros, 10 microlitros e 20 microlitros de uma solução a 100% de acetonitrila a três placas de células contendo dois mililitros de meio de crescimento para cada volume adicionado de solução de acetonitrila para servir como controle do veículo. Depois de adicionar a acetonitrila, incube as placas.
Para realizar experimentos de resposta ao tempo, adicione sete microlitros de uma solução estoque de 20 milimolares de fenantreno em acetonitrila a 100% a três placas de células, contendo dois mililitros de meio de crescimento para cada ponto de tempo. Em seguida, adicione sete microlitros de acetonitrila a 100% a três placas de células, contendo dois mililitros de meio de crescimento para cada ponto de tempo, para servir como controle do veículo. Incube as placas para cada ponto de tempo designado.
Descarte o meio de cultura despejando suavemente o meio. Enxágue as células com três mililitros de PBS e transvase ou aspire entre os enxágues. Pipete um mililitro de um miligrama por mililitro de corante amarelo de lúcifer dissolvido em PBS em cada placa celular.
Pré-carregue o corante nas células apertando o bisturi entre o dedo indicador e o polegar. Coloque o bisturi perpendicular e a cinco milímetros da borda da placa de cultura e, em seguida, use a gravidade para permitir que o bisturi role suavemente desse ângulo perpendicular para um ângulo de 15 graus. Role a lâmina através de uma população de células em três áreas diferentes da placa total.
Em seguida, incube as células com a solução LY por três minutos em temperatura ambiente. Transvase ou aspire o LY e enxágue as células para remover todo o corante extracelular e eliminar a fluorescência de fundo extracelular. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de uma solução de formalina tamponada com fosfato a 4% para fixar as células.
Visualize as células fixas usando um microscópio de epifluorescência com ampliação de 200x. Alinhe todas as placas de modo que a linha de recuo fique paralela ao campo de visão horizontal. Uma série de imagens SL-DT foi gerada de células epiteliais hepáticas de ratos WB-F344 tratadas com doses crescentes de fenantreno.
A diminuição na migração do corante fluorescente amarelo de lúcifer é causada pelo aumento das doses de fenantreno, demonstrando a crescente inibição induzida por tóxicos da comunicação intercelular da junção comunicativa, ou GJIC. A fração dos valores de controle, ou FOC, obtida a partir das imagens SL-DT foi calculada, analisada estatisticamente e, em seguida, representada graficamente. Após este procedimento, outros métodos, como western blots de proteínas de transdução única, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais.
Tipo, esses compostos estão ativando eventos mitogênicos de perfuração celular?
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Visão Geral
Este protocolo descreve uma técnica de transferência de corante fluorescente com carregamento por bisturi que mede a comunicação intercelular por meio de canais de junções comunicantes. Este método fornece um ensaio simples para avaliar a comunicação intercelular mediada por junções comunicantes em células de mamíferos, o que é crucial para compreender a homeostase tecidual.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Toxicologia
Antecedentes
- A comunicação intercelular por junções de fenda é essencial para a manutenção da homeostase tecidual.
- A interrupção dessa comunicação pode levar a efeitos adversos à saúde.
- Esta técnica permite uma avaliação rápida da função das junções de fenda.
- Ela pode ser aplicada em diversos estudos farmacológicos e toxicológicos.
Objetivo do Estudo
- Medir os efeitos de compostos na comunicação intercelular por junções de fenda.
- Fornecer um método confiável para avaliar o desenvolvimento e a manutenção de tecidos.
- Facilitar pesquisas em toxicologia sobre o impacto de toxinas na comunicação celular.
Métodos Utilizados
- Plante células epiteliais hepáticas de rato WB-F344 em placas de cultura.
- Cultive as células até atingir confluência de 100%.
- Aplicar tratamentos experimentais às células.
- Utilize a transferência de corante fluorescente para avaliar a comunicação intercelular.
Resultados Principais
- A técnica permite a avaliação da função das junções comunicantes em grandes populações celulares.
- Fornece informações sobre como os tóxicos afetam a comunicação intercelular.
- Efetividade demonstrada em diversos estudos in vitro.
- Um protocolo rápido e simples aumenta a eficiência da pesquisa.
Conclusões
- Este método é uma ferramenta valiosa para pesquisas toxicológicas.
- Ele auxilia na compreensão do papel das junções comunicantes na saúde dos tecidos.
- Estudos futuros podem ampliar suas aplicações em farmacologia.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A comunicação intercelular por junções do tipo fenda (GJIC) atua como um biomarcador funcional para avaliar a perturbação da homeostase tecidual por agentes tóxicos e para avaliar os efeitos protetores de produtos naturais. A técnica de carregamento com bisturi-transferência de corante fluorescente (SL-DT) permite uma avaliação rápida e em nível populacional da inibição da GJIC, apoiando a desmistificação mecanicista no estágio inicial de descoberta. Este ensaio fornece confiança preditiva para priorizar compostos com base em seu impacto nas vias de comunicação celular críticas para a função orgânica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Analisa hipóteses terapêuticas ao associar a exposição ao composto à perturbação da comunicação intercelular mediada por junções de gap como mecanismo de toxicidade.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio da medição direta da atividade dos canais intercelulares em populações de células vivas.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao identificar biomarcadores precoces de efeitos adversos na manutenção tecidual e na homeostase.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho posteriores, estabelecendo a competência basal de CICT.
- Valor Operacional: Fornece leituras padronizadas e quantitativas de transferência de corante passíveis de automação e de imagens de alto rendimento.
- Escalabilidade: Adaptado para fatias de tecidos in vivo e compatível com microscopia de fluorescência automatizada para aumento da capacidade de processamento de amostras.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta descobertas científicas à validação pré-clínica por meio de mecanismos conservados de CICG em diferentes espécies.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece se os fenótipos observados decorrem da comunicação intercelular interrompida, e não de efeitos fora do alvo.
- Decisões com Base no Risco: Orienta critérios de avanço ao quantificar relações estrutura-atividade na modulação da CICG.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio SL-DT atua como uma ferramenta de descoberta para obtenção de insights mecanicistas, posicionado antes da otimização de compostos líderes, a fim de filtrar substâncias com alto risco de disruptão tecidual.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao quantificar como toxicantes ou produtos naturais alteram as redes de sinalização intercelular.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio de leituras funcionais reprodutíveis, baseadas em populações, que refletem a comunicação em nível tecidual.
- Análises: Gera valores da fração do controle (FOC) que permitem comparação estatística entre diferentes doses e pontos temporais.
- Pesquisa Translacional: Alinha-se a estratégias de biomarcadores ao associar a função da comunicação por junções de gap (GJIC) a desfechos de integridade tecidual em modelos pré-clínicos.
- Reutilização Corporativa: Atua como uma plataforma reutilizável em programas de desenvolvimento em toxicologia, farmacologia e nutracêuticos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao fornecer uma leitura funcional direta da atividade dos canais de junção comunicante.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio do carregamento simples com bisturi e da aquisição de imagens em ponto final fixo.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção ao associar a interrupção precoce da comunicação via junções comunicantes a efeitos adversos teciduais posteriores.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco ao identificar compostos que preservam a homeostase da comunicação intercelular.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de células, manipulação de corantes fluorescentes e microscopia de epifluorescência.
- Depende de técnica padronizada com bisturi e tempos de incubação consistentes para transferência confiável do corante.
- Necessita de consenso entre as equipes quanto aos limiares de análise de imagens e parâmetros morfométricos.
- Adaptável a diferentes tipos de células de mamíferos e fatias de tecido, com otimização dos parâmetros de carregamento e fixação.
- Limita-se à avaliação da atividade funcional dos canais; não distingue entre expressão de conexinas, fosforilação ou estados de comporta.
