Adenofection: Um método para estudar o papel de chaperones moleculares em Cellular Morfodinâmica por experimentos depleção de resgate

O objetivo geral deste método é permitir a realização de experimentos de resgate por esgotamento em condições que preservem a integridade celular e a homeostase proteica para análises funcionais de processos biológicos no nível de célula única.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre funções proteicas e requisitos estruturais na dinâmica celular, como mitose e diferenciação celular. A principal vantagem desta técnica é esgotar uma proteína de interesse e reintroduzir, ao mesmo tempo, uma variante dessa proteína em níveis próximos ao fisiológico na maioria de uma população celular.

Inicie revestindo as placas com fundo de vidro com fibronectina. Para isso, dilua um estoque de fibronectina de um miligrama por mililitro na proporção de um para 100 com PBS estéril.

Adicione um mililitro a cada placa de 35 mililitros para cobrir toda a superfície. Incube por uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Durante a incubação, pré-aqueça o meio alfa MEM suplementado com 10% de FBS e uma alíquota de tripsina EDTA 0,05% a 37 graus Celsius.

Após 45 minutos de incubação, comece a preparar a solução celular. Aspire o meio de uma placa de 10 centímetros de células HeLa-RFP-H2B e lave suavemente duas vezes com 1,5 mililitros de tripsina-EDTA 0,05%.

Deixe 0,5 mililitros de tripsina EDTA na placa após a última aspiração e incube as células por dois a três minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Bata levemente no fundo da placa e observe a camada de células ao microscópio para verificar se todas as células foram destacadas. Em seguida, adicione 10 mililitros de meio e pipete delicadamente várias vezes para separar as células e transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros.

Conte uma amostra de 10 microlitros da suspensão celular utilizando um hemocitômetro. Em seguida, aspire a solução de fibronectina dos recipientes com fundo de vidro. Não permita que a fibronectina seque antes do plaqueamento celular.

Prepare uma solução de suspensão celular para semear 1,5 vezes dez à quinta potência de células por placa de 35 milímetros em dois mililitros de meio. Plaque uma placa adicional de 35 milímetros além do número de condições, a fim de contar o número de células antes da transdução viral. Incube por 30 a 45 minutos. Após o tempo de incubação, verifique as células ao microscópio para garantir que estejam bem separadas, conforme mostrado aqui. Retorne as placas ao incubador e cultive as células até o dia seguinte.

No dia seguinte ao plaqueamento, certifique-se de que as células tenham atingido uma densidade de pelo menos 50%. Uma densidade celular inferior a 50% resulta em eficiência reduzida de transdução viral, aumento da variação na expressão proteica por célula e maior toxicidade celular. Em seguida, recolha as células do recipiente adicional plaqueado como anteriormente e conte o número de células. Calcule o volume de vírus necessário para uma transdução eficiente das células. Rotule um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para cada condição e adicione 400 microlitros de alfa MEM quente sem soro. Após descongelar lentamente as alíquotas dos vírus no gelo, adicione o volume necessário de cada vírus aos tubos e misture suavemente por pipetagem. Em seguida, após aspirar o meio das células, adicione cuidadosamente a mistura de vírus gota a gota. Incube as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. A cada 15 minutos, durante um período de uma hora, agite as placas cuidadosamente sob a capela estéril para cobrir as células com o vírus. O uso de uma pequena quantidade de meio facilita o contato do vírus com as células.

Após a incubação, pipete gentilmente 1,6 mililitros de alpha MEM sem aditivos para cada placa para obter um volume total de dois mililitros. Em seguida, inicie a sincronização celular adicionando timidina 2 milimolar antes de incubarmos as células por mais duas horas.

Enquanto isso, prepare a mistura de transfeção de siRNA adicionando em um microtubo 139 microlitros de água estéril, 50 microlitros de cloreto de cálcio um molar e 11 microlitros de siRNA vinte micromolar. Se nenhum siRNA for necessário, substitua a quantidade de siRNA por água estéril para realizar uma transfeção vazia. Adicione lentamente, gota a gota, a solução HBSS-2X sobre a mistura de cloreto de cálcio e siRNA. Misture suavemente duas vezes por injeção de ar utilizando uma pipeta de 200 microlitros, pois precipitados menores resultam em maior eficiência de transfeção. Incube então a mistura por 30 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, adicione lentamente 200 microlitros, gota a gota, a cada placa e agite para misturar. Incube as placas a 37 graus Celsius, 5% dióxido de carbono, por 16 horas.

No dia seguinte, retire as placas do incubador e transporte-as para uma câmara de cultura de tecidos. Após lavar as células duas vezes com dois mililitros de HEPES morno, adicione dois mililitros de alpha MEM sem antes devolver ao incubador.

Sete horas depois, adicione timidina a dois milimolares aos poços antes de devolvê-los à incubadora. Trabalhe com no máximo quatro placas celulares por vez, pois variações de temperatura afetam a duração do ciclo celular. No dia seguinte, 48 horas após a transfeção com siRNA e infecção viral, lave as células duas vezes com dois mililitros de PBS morno e depois adicione dois mililitros de MEM alfa sem vermelho de fenol para a microscopia de células vivas. Incube por sete horas.

Realize experimentos de microscopia de células vivas de curto prazo em células mitóticas com um microscópio invertido equipado com uma câmara umidificada regulada termicamente contendo 5% de dióxido de carbono. Antes da aquisição, verifique se a câmara atingiu a temperatura apropriada de 37 graus Celsius.

Coloque as placas de cultura na câmara do microscópio uma hora antes da aquisição para permitir o equilíbrio adequado do meio e evitar desvios de foco devido a mudanças de temperatura. Examine o estado mitótico das células. Neste ponto, 10 a 15% das células devem estar nos estágios iniciais da mitose.

Durante o tempo de equilíbrio, configure os parâmetros de aquisição conforme determinado em experimentos anteriores. É importante obter uma resolução adequada sem fotodesbotamento, pois isso causa danos celulares e perturba a progressão mitótica. Escolha vários campos contendo células que estejam entrando na mitose por condição, a fim de obter um número significativo de células para análise, sem exceder o intervalo de aquisição. Após a seleção de todos os campos, reajuste o foco e inicie a aquisição o mais rapidamente possível.

Usando um sistema confocal de disco giratório, uma configuração típica incluiria quatro condições diferentes, sete campos por placa e dois canais de cor com intervalos de um minuto e meio a dois minutos ao longo de um período de 75 minutos. Determine critérios bem definidos para analisar fenótipos mitóticos em células, o que dependerá dos marcadores fluorescentes utilizados.

Em contraste com a transfeção de BAG3-GFP, o DNA plasmidial, como visto à esquerda, a adenofecção com adenovírus recombinantes mostrada aqui à direita permite uma expressão mais homogênea e eficiente de BAG3-GFP, na maioria da população celular, com baixa multiplicidade de infecção. Este bloteamento ocidental representativo mostra que a adenofecção com siRNAs específicos para BAG3 e o adenovírus recombinante BAG3-GFP permite o esgotamento eficiente do BAG3 endógeno e a reintrodução da proteína BAG3-GFP em níveis próximos aos endógenos. Como mostrado aqui, a adenofecção pode preservar a homeostase proteica, já que não há aumento detectável nos níveis das proteínas de choque térmico induzidas por estresse em células HeLa que foram adenofectadas, em contraste com células HeLa tratadas com o indutor de estresse proteotóxico, MG132. Aqui observamos que a progressão das células pela mitose não é significativamente perturbada pela adenofecção, conforme demonstrado por estas imagens confocais de lapso de tempo de células HeLa adenofectadas com siRNA controle e BacMam-GFP alfa Tubulina, e BacMam-RFP Actina.

O gráfico indica a proporção de células com mitose anormal. Células adenofetadas apenas com siRNA específico para BAG3 exibiram um aumento aproximado de duas vezes no nível de defeitos mitóticos, conforme representado pela barra vermelha, o qual foi restaurado a níveis próximos ao das células controle pela reintrodução de BAG3-GFP, mostrada pela barra preta.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar experimentos de resgate por esgotamento usando adenofecção. Este método fornece um sistema rápido e simples para criar diminuições hipomórficas para análise estrutura-função em diversos contextos celulares. A partir deste método, é possível identificar os requisitos estruturais essenciais da proteína de interesse para uma função específica. Outras abordagens de edição genômica podem então ser utilizadas para aprofundar os mecanismos envolvidos.