No estudo in vivo da Human Interaction Endotelial-pericyte usando o plug Ensaio Matrix Gel no mouse
19 de dezembro de 2016
Nós apresentamos um protocolo para estudar as interações endotelial-pericyte humanos no rato usando uma variação do ensaio plugue angiogênese gel matriz.
O objetivo geral deste ensaio de gel matriz in vivo é investigar a interação de células endoteliais com parasitas. Este ensaio com matrigel foi desenvolvido para ajudar pesquisadores a estudar as principais etapas da androgênese. Além disso, permitirá a identificação de vias de sinalização responsáveis por etapas fundamentais na formação de vasos sanguíneos, bem como de genes cuja disfunção pode levar a distúrbios vasculares e outras aberrações da androgênese.
A principal vantagem desta técnica é que ela nos permite estudar a formação de vasos sanguíneos in vivo envolvendo tanto as células endoteliais quanto suas células de suporte, os pericitos. Para começar, cultive culturas de células endoteliais humanas e de parasitas em placas de 100 milímetros com 10 mililitros do meio apropriado. Troque o meio a cada dois ou três dias até que as células atinjam 80% de confluência.
Para preparar a solução de gel de matriz para misturar com as células, descongele um estoque de gel de matriz durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, faça alíquotas de 1,5 mililitro para armazenamento a menos vinte graus Celsius a longo prazo, ou a quatro graus Celsius por até duas semanas. Cada tampão experimental exigirá 200 microlitros de gel de matriz.
Assim, um tubo estocado pode fornecer seis plugs com um excesso de 25%. Prepare cada alíquota necessária para uso adicionando 15 microlitros do estoque descongelado de beta-FGF 100x. Misture o beta-FGF na solução por pipetagem, depois incube no gelo por pelo menos 30 minutos antes de adicionar as células.
Neste momento, refrigere algumas seringas de insulina de 1 cc com agulha de 28 graus para as injeções. Para coletar as células das placas de cultura, remova o meio e lave as células uma vez com PBS. Após a remoção do PBS, adicione um mililitro de solução de tripsina e retorne as placas ao incubador por um minuto.
Em seguida, pipete dois mililitros de meio de cultura sobre as placas para destacar as células e colete o meio em um tubo de 15 mililitros. Agora, verifique a concentração das amostras utilizando um hemocitômetro. Em seguida, prepare alíquotas de células em tubos de 15 mililitros.
Uma combinação de um milhão de células endoteliais e 200.000 parasitas é utilizada aqui para o grupo experimental. Em seguida, centrifugue as alíquotas celulares a 400g durante cinco minutos. Então, adicione o volume calculado de gel de matriz ao pellet celular e misture com pipetagem suave para não formar espuma, pois bolhas de ar não podem ser injetadas.
Agora mantenha os preparos em gelo até que os camundongos estejam prontos para a injeção. Após anestesiar um camundongo com isoflurano e confirmar o estado anestesiado com um aperto no dedo do pé, fixe o camundongo ao sistema não reinalante que fornece isoflurano e coloque-o sobre o tapete aquecido, com a face ventral voltada para baixo. Em seguida, remova cerca de um centímetro quadrado de pelos de ambas as regiões laterais traseiras.
Em seguida, limpe a pele exposta com álcool 70%. Depois, carregue um mililitro da solução celular preparada em uma seringa gelada, o que é suficiente para quatro implantes. Para realizar a injeção, levante a pele do dorso para localizar o espaço subcutâneo.
Em seguida, injete lentamente 200 microlitros de forma uniforme no espaço subcutâneo posterior à caixa torácica e retire lentamente a agulha para evitar vazamentos. Após a injeção, formará-se uma saliência no local. Limpe o local com álcool e, em seguida, contorne a saliência com marcador permanente para que possa ser localizada posteriormente.
Em seguida, repita o procedimento de injeção no outro lado do camundongo. Certifique-se de injetar todas as células dentro de três minutos, caso contrário elas começarão a aderir à seringa. A etapa de injeção é crítica e deve ser bem realizada para garantir que a rolha de gel de matriz se forme entre as camadas da pele e do músculo, de modo que a rolha mantenha uma boa forma e não se torne difusa.
Antes de prosseguir para injetar o próximo camundongo, deixe o camundongo injetado permanecer sobre a placa aquecida por um minuto para dar tempo à matriz de gelificar. Após a eutanásia, posicione o camundongo na mesa cirúrgica. Após remover qualquer pelo que tenha crescido novamente no local da injeção, localize as linhas de marcação que identificam a posição do tampão.
Em seguida, utilizando tesoura cirúrgica fina, faça uma incisão ao longo da borda marcada do fragmento, perpendicularmente à pele e até o músculo subjacente. Corte cuidadosamente ao redor da periferia da borda marcada. Em seguida, remova o fragmento, mantendo-o entre as camadas de pele e músculo.
Lave imediatamente o coágulo em um béquer pequeno contendo PBS para remover o sangue. Em seguida, coloque todo o coágulo em um tubo de 50 mililitros com 25 mililitros de paraformaldeído 4%. Deixe fixar à temperatura ambiente por 24 horas sem qualquer agitação.
No dia seguinte, transfira os fragmentos para 25 mililitros de etanol 70% por 24 horas. Em seguida, prossiga com a inclusão em parafina. Secções de fragmentos contendo apenas células endoteliais mostram que alguns vasos não são perfundidos com o sangue do hospedeiro após 14 dias in vivo.
Em contraste, os plugs contendo tanto células endoteliais quanto parasitas exibem muitos vasos perfundidos após 14 dias in vivo. Esses plugs possuem células positivas para marcação de actina de músculo liso, vistas em vermelho, imediatamente adjacentes a células endoteliais positivas para CD31, vistas em verde. Portanto, os parasitas podem desempenhar um papel substancial na formação de novos vasos sanguíneos.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como aplicar esta poderosa técnica in vivo para estudar a formação de vasos sanguíneos em múltiplos tipos celulares. Esta técnica abrirá caminho para que pesquisadores explorem diversas áreas da biologia vascular em modelos de camundongos. Após este procedimento, outros métodos, como PCR quantitativa e imunoblotagem ocidental, também podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como alterações na expressão gênica e proteômica.
Essa técnica poderosa permitirá ao pesquisador estudar in vivo como as células endoteliais e os parasitas interagem durante a formação dos vasos sanguíneos, que é uma etapa fundamental na androgênese. Essa técnica poderosa também permitirá ao pesquisador estudar outras interações entre células que são relevantes para a compreensão de doenças vasculares, como a hipertensão pulmonar, entre outras.
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Visão Geral
Este protocolo apresenta um método para estudar as interações endoteliais-pericitárias humanas in vivo utilizando um ensaio de angiogênese em tampão de gel de matriz. O ensaio tem como objetivo elucidar as vias de sinalização envolvidas na formação de vasos sanguíneos e identificar genes associados a distúrbios vasculares.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Angiogênese
- Interações celulares
- Biologia vascular
Antecedentes
- A interação entre células endoteliais e pericitos é crucial para a estabilidade dos vasos sanguíneos.
- Compreender essas interações pode fornecer informações sobre distúrbios vasculares.
- O ensaio de tampão de gel de matriz permite a observação in vivo desses processos.
- Estudos anteriores destacaram a importância das vias de sinalização na angiogênese.
Objetivo do Estudo
- Investigar as interações entre endotélio e pericitos.
- Identificar as vias de sinalização envolvidas na formação de vasos sanguíneos.
- Explorar genes que podem levar a distúrbios vasculares quando disfuncionais.
Métodos Utilizados
- Ensaio in vivo com gel de matriz.
- Cultivo de células endoteliais e pericitos humanos.
- Observação da formação de vasos sanguíneos.
- Análise de vias de sinalização e expressão gênica.
Resultados Principais
- Estabelecimento bem-sucedido de interações entre endotélio e pericitos in vivo.
- Identificação das principais vias de sinalização envolvidas na angiogênese.
- Informações sobre genes associados a distúrbios vasculares.
- Demonstração das vantagens do ensaio de matriz em gel.
Conclusões
- O ensaio de coágulo de gel matriz é eficaz para estudar as interações entre endotélio e pericitos.
- Os achados contribuem para a compreensão da formação de vasos sanguíneos.
- Implicações potenciais para estratégias terapêuticas direcionadas a distúrbios vasculares.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este ensaio de implante de gel matriz in vivo preenche uma lacuna crítica na pesquisa de angiogênese, permitindo o estudo das interações humanas entre endotélio e pericitos em um microambiente fisiológico, essencial para reduzir riscos na validação de alvos vasculares e melhorar a confiança preditiva em modelos pré-clínicos. O ensaio possibilita estudos mecanicistas de maturação de vasos sanguíneos e recrutamento de pericitos, conferindo relevância translacional para distúrbios vasculares pulmonares e sistêmicos. Ele complementa os sistemas in vitro existentes ao fornecer leituras funcionais, como a formação de vasos perfundidos e a cobertura por pericitos, diretamente aplicáveis aos fluxos de trabalho de validação de alvos e identificação de compostos líderes na pesquisa e desenvolvimento biofarmacêuticos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar hipóteses terapêuticas relativas à sinalização endotelial-pericitária na maturação vascular.
- Valor Operacional: Oferece um sistema relevante para a doença, capaz de avaliar o engajamento de alvos e a modulação de vias in vivo.
- Valor Científico: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao esclarecer o papel funcional dos pericitos na estabilidade e perfusão dos vasos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera saídas quantitativas baseadas em histologia, incluindo comprimento, número, tamanho dos vasos e cobertura por pericitos, para análise comparativa.
- Valor Operacional: Fornece leituras vasculares padronizadas e reprodutíveis, adequadas para validação de ensaios e cascatas de triagem de compostos.
- Valor Científico: Permite a preparação de sistemas biológicos validados para avaliação posterior de candidatos angiogênicos ou antiangiogênicos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Oferece um modelo relevante para a doença no estudo de distúrbios vasculares, como hipertensão pulmonar, por meio do enxerto de células humanas em camundongos imunocomprometidos.
- Valor Operacional: Facilita o alinhamento translacional de biomarcadores ao associar a cobertura de pericitos e a maturação dos vasos a desfechos funcionais.
- Valor Científico: Apoia a continuidade pré-clínica ao permitir a avaliação de intervenções genéticas ou farmacológicas na formação da rede vascular.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líderes e a avaliação pré-clínica, especialmente para programas de biologia vascular que exigem validação funcional de mecanismos angiogênicos ou de estabilização de vasos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao permitir a observação da comunicação endotelial-pericitária em um microambiente vivo.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio da formação padronizada de tampões, fixação e seccionamento para análise histológica quantitativa.
- Análises: Fornece leituras baseadas em morfometria e perfusão (tamanho e número de vasos, cobertura por pericitos, lúmens contendo hemácias) que permitem a avaliação comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao modelar in vivo interações vasculares humanas, relevantes para a angiogênese pulmonar e sistêmica.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma reutilizável para estudos genéticos, investigação de vias e campanhas de descoberta de fármacos direcionadas a alvos vasculares.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista na validação de alvos vasculares por meio da observação direta da maturação de vasos dependente de pericitos.
- Valor Operacional: Aprimora a reprodutibilidade e padronização por meio de proporções definidas de células, preparação de gel de matriz e protocolos de quantificação histológica.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção do projeto ao fornecer dados funcionais de maturação vascular em estágios mais precoces do processo de descoberta.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos vasculares com base no recrutamento de pericitos e na funcionalidade vascular in vivo.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cultura de células humanas primárias, técnicas cirúrgicas estéreis e processamento histológico.
- Depende de modelos de camundongos imunocomprometidos (por exemplo, SCID) e acesso a gel de matriz, marcadores de perfusão e reagentes para imuno-histoquímica.
- Necessita padronização entre equipes para o preparo celular, consistência na injeção e análise histológica cega.
- As considerações para adaptação incluem fontes celulares específicas de espécies, tipos de pericitos e testes de compostos angiogênicos versus antiangiogênicos.
- As limitações práticas incluem a duração do ensaio de 14 dias, a variabilidade na recuperação do plug e a dependência da análise histológica em ponto final, em vez de imagem em tempo real.
