Um protocolo otimizado para a mobilidade eletroforética ensaio de desvio usando oligonucleotídeos Infrared corante fluorescente-etiquetados

O objetivo geral deste ensaio é detectar interações proteína-DNA usando sondas não radioativas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da biologia molecular e bioquímica, como a determinação da sequência alvo de proteínas do DNA. A principal vantagem dessa técnica é que ela é uma alternativa fácil, segura e que economiza tempo ao uso de sondas radioativas.

Para iniciar este procedimento, prepare um gel de poliacrilamida nativo a cinco por cento contendo 0,5x borato de tris EDTA ou TBE e 2,5% de glicerol usando um sistema de mini gel de proteína. Para preparar 30 mililitros de solução de gel para quatro géis, misture água destilada, TBE, persulfato de amônio, TEMED, acrilamida bis e glicerol. Passe a solução de gel imediatamente.

Após a polimerização, embrulhe os géis em filme plástico transparente pré-umedecido com 0,5x TBE e armazene-os a quatro graus Celsius. Em seguida, projete um oligonucleotídeo longo para aproximadamente 51 mers. Projete oligonucleotídeos curtos complementares para aproximadamente 14 meros com modificação de corante fluorescente infravermelho nos cinco terminais principais.

Uma vez preparados os oligonucleotídeos, ressuspenda-os em tampão Tris-EDTA 1x até uma concentração final de 100 micromolares. Para recozimento, misture 0,6 microlitros de cinco oligonucleotídeos curtos de corante primário, 1,2 microlitros de oligonucleotídeo longo e 28,2 microlitros de tampão Tris-EDTA de cloreto de sódio em um tubo de 1,5 mililitro. Coloque o tubo em água fervente por cinco minutos, depois desligue a fonte de calor e deixe a água com os oligonucleotídeos recozidos esfriar durante a noite no escuro.

Para fazer sondas de DNA de fita dupla, misture 30 microlitros dos oligonucleotídeos recozidos com DNTPs, tampão Klenow, etiqueta de corante Klenow five prime e água destilada dupla em um tubo de PCR de 0,2 mililitro. Incube a mistura por 60 minutos a 37 graus Celsius em uma máquina de PCR. Em seguida, adicione 3,4 microlitros de EDTA 0,5 molar para interromper a reação e inative o calor a 75 graus Celsius por 20 minutos na máquina de PCR.

Em seguida, dilua as sondas preenchidas com tampão Tris-EDTA de cloreto de sódio até uma concentração final de 0,1 micromolar. Armazene os oligonucleotídeos a menos 20 graus Celsius no escuro até que estejam prontos para uso. Para preparar sondas não marcadas, misture 20 microlitros de oligonucleotídeo longo, 20 microlitros de oligonucleotídeo Long R e 60 microlitros de tampão Tris-EDTA de cloreto de sódio em um tubo de 1,5 mililitro.

Coloque o tubo em água fervente por cinco minutos, depois desligue a fonte de calor e deixe a água com os oligos recozidos esfriar durante a noite. Prepare um mililitro de tampão de ligação 5x misturando Tris HCl, Cloreto de Sódio, Cloreto de Potássio, Cloreto de Magnésio, EDTA, DTT, BSA e água bidestilada Antes de configurar as reações de ligação, execute previamente o gel de poliacrilamida nativo a 5% em 0,5x TBE e 2,5% de glicerol para remover todos os vestígios de persulfato de amônio a 80 volts por 30 minutos a uma hora, ou até que a corrente não varie mais com o tempo.

Em seguida, misture quatro microlitros de tampão de ligação 5x, 80 a 200 nanogramas de proteína A purificada, um microlitro de sonda conjugada com corante 0,1 micromolar e água bidestilada Incube a mistura em temperatura ambiente no escuro por 15 minutos. Após a incubação, carregue toda a reação de ligação no gel e execute o gel a 10 volts por centímetro até a distância desejada.

Cubra o aparelho de gel com alumínio para manter o gel no escuro o máximo possível. Limpe o leito do scanner de um sistema de imagem infravermelha com água destilada. Seque as placas de vidro que contêm o gel e coloque-as na base do scanner.

Abra o software de imagem infravermelha e clique na guia Adquirir. Para placas mais grossas, use as configurações de 700 para canal, automático para intensidade, 84 micrômetros para resolução, médio para qualidade e 3,5 milímetros para deslocamento de foco. Selecione a área que o gel ocupa no scanner.

Por fim, clique em Iniciar para iniciar a verificação. O progresso da eletroforese pode ser visualizado com o corante de carregamento Orange G, enquanto o azul de bromofenol é detectado durante a varredura e, portanto, interfere na análise da imagem. A adição de dI-dC à reação de ligação aboliu a ligação de 6xHis-SOX-2 purificado com as cinco sondas de DNA de corante principal.

O mutante LIM-4 e a sonda fria SOX-2 mutada no local de ligação do LIM-4 são tão eficientes quanto a sonda fria do tipo selvagem em competir com a sonda marcada com corante fluorescente infravermelho para ligação a 6xHis-SOX-2. No entanto, a eficiência de competição da sonda fria mutante LIM-4 e SOX-2 mutada no local de ligação SOX-2 é muito menor do que a sonda fria do tipo selvagem para ligação a 6xHis-SOX-2. Ensaios de superdeslocamento do complexo de DNA SOX-2 usando epítopos 6xHis e bandeira resultaram em uma banda de DNA SOX-2 superdeslocada.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas a quatro horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter as sondas infravermelhas no escuro. Após este procedimento, outros métodos, como a edição do genoma CRISPR cas9, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a importância de uma determinada sequência de ligação ao DNA.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da bioquímica explorarem as interações proteína-DNA em vários organismos modelo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como determinar as interações proteína-DNA usando marcadores de DNA não radioativos. Não se esqueça de que trabalhar com acrilamida pode ser extremamente perigoso e precauções como equipamentos de proteção individual devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.