Imuno-histoquímica em parafina da epiderme do rato utilizando anticorpos fluorescentes

No epitélio. A imuno-histoquímica é um método eficiente para localizar proteínas específicas em seu compartimento de expressão. Neste vídeo, demonstramos um método confiável para a imunolocalização de proteínas no epitélio, que utilizamos rotineiramente em nosso laboratório.

Olá, sou a Tammy do Laboratório do Dr. Turin, aqui no prédio baixo do Instituto de Pesquisa em Saúde de Ottawa, no programa de doenças crônicas. Hoje vamos mostrar um procedimento de imuno-histoquímica utilizando anticorpos fluorescentes em cortes de tecido de epiderme de camundongo embebidos em parafina. Em nosso laboratório, otimizamos protocolos para imunolocalização de marcadores de diferenciação epidérmica utilizando tecido fixado com BO'S.

Como parte da otimização, mantemos a pele plana ao dispô-la sobre papel toalha antes da fixação. Este procedimento envolve a dissecação da epiderme, fixação, desidratação, inclusão em parafina, corte de seções, desparafinização, reidratação, exposição de antígenos, marcação com anticorpos e, finalmente, montagem e visualização por fluorescência epiluminiscente. Então, vamos começar.

Ao usar camundongos neonatos, não é necessário rapar a pele das costas. No entanto, quando se tem camundongos mais velhos que possuem pelos, é preciso rapar a pele das costas para que ela não atrapalhe o corte das seções. Ao realizar sua dissecação, é importante ter muito cuidado para não colocar a pinça nas áreas da pele que você pretende usar para seu ensaio.

Então, o que fazemos é colocar a pinça ao redor da borda do local onde vamos cortar e, em seguida, levantamos cuidadosamente, cortamos a epiderme, lembrando de não tocar a área que você deseja usar para o seu experimento. Ao fixar a pele, não queremos que ela enrole e fique dentro do tubo. Queremos que fique bem plana.

Então, o que fazemos para auxiliar nisso é colocar a pele sobre uma toalha de papel para que ela permaneça plana durante a fixação. Agora que temos a pele bem achatada sobre a toalha de papel, o que fazemos é cortar as bordas ou aparar as extremidades para remover as partes que possam ter sido danificadas com a pinça. Em seguida, corta-se a pele em pedaços muito pequenos, de aproximadamente dois milímetros por dois milímetros.

Agora o tecido será fixado. Após cortar a pele em pedaços manuseáveis, imerja-a na solução boin. Tampe os tubos, envolva-os com perfil e coloque-os em um agitador.

Para uma incubação durante a noite, é importante incubá-la na solução boin apenas por 16 a 18 horas. Períodos de fixação mais curtos ou mais longos danificarão seu tecido. A incubação está concluída.

Você lava o tecido com PBS e, em seguida, realiza uma série de lavagens com etanol usando álcool a 30%, 50% e 70%. Pode-se observar que o BO é amarelo e que, à medida que as lavagens são realizadas e o BO é diluído, a cor da lavagem vai ficando cada vez menos amarela. Realize duas lavagens, cada uma de 30 minutos.

Após a última lavagem em amostras de etanol, estas são colocadas em etanol a 70% fresco e podem ser armazenadas a quatro graus Celsius até o processamento posterior, com alguns ventos de parafina. Inclusão. Uma vantagem do uso de tecidos congelados é que a integridade tecidual é superior e as amostras podem ser armazenadas por longos períodos. Em geral, as instalações centrais geram resultados mais reprodutíveis.

No entanto, se você dispõe da infraestrutura e de um operador dedicado com expertise, os cortes podem ser realizados internamente. Aprender a confeccionar bons cortes é, de fato, uma forma de arte. Por isso, utilizamos uma instalação central.

Após receber as lâminas de volta da instalação central, você pode observar que a parafina está presente nas lâminas. Na forma de uma película fina, as lâminas são colocadas em uma grade envolvida com papel alumínio, como uma batata assada, e incubadas por cinco minutos a 55 graus. Após a incubação, desenrole rapidamente as lâminas e coloque-as em tolueno para três lavagens de cinco minutos.

É muito importante lembrar que essas lavagens de cinco minutos devem ser rigorosamente cronometradas, pois uma incubação excessiva fará com que o tolueno prejudique seus espécimes. Após as três lavagens e o tolueno, realize uma rápida rinsão em etanol a cem por cento. Como o etanol e o tolueno formam um precipitado que interferirá em seu experimento, esta é uma etapa muito importante a ser lembrada.

Em seguida, as amostras são reidratadas incubando as lâminas por cinco minutos em etanol 95%, cinco minutos em etanol 70% e, depois, duas vezes por cinco minutos em água. Neste ponto, os tecidos podem ser processados para coloração com hematoxilina e eosina (h e e). Também utilizamos a instalação central para essa finalidade.

Para a desobstrução de antígenos, coloque 500 mL de tampão citrato uma vez em um béquer plástico de um litro e imerja suas lâminas. Lembre-se de remover o cabo metálico e coloque o béquer no micro-ondas. Aqueça no micro-ondas em potência máxima por dois períodos de cinco minutos.

Lembre-se de abrir a porta do micro-ondas para resfriá-lo entre as duas incubações. Após a irradiação no micro-ondas, remova as lâminas do tampão de citrato em ebulição e coloque-as em um recipiente de coloração contendo água morna. Utilizamos apenas água da torneira morna, cujo objetivo é resfriar lentamente as lâminas da temperatura de ebulição até a temperatura ambiente.

Agora você pode lavar as lâminas três vezes por cinco minutos em PBS e estamos prontos para iniciar a imuno-histoquímica. A primeira coisa que precisamos fazer para começar a imunomarcação é secar a área ao redor de nossos espécimes com um pedaço de papel-toalha. Para evitar contaminação cruzada de anticorpos, delimitamos a área ao redor dos nossos espécimes com um bloqueador líquido.

Prepare uma câmara umidificada colocando um papel-filtro em uma placa de Petri. Umedeça-o com água, remova o excesso de água e insira suas lâminas. O motivo pelo qual utilizamos uma câmara umidificada é garantir que, durante os períodos de incubação, as lâminas não sequem.

É muito importante que as lâminas não sequem, pois o ressecamento aumentará seu fundo. As lâminas são bloqueadas neste momento com tampão de incubação por 30 minutos. Após o bloqueio, transfira suas lâminas de volta para o suporte de lâminas e incube em tampão de lavagem.

Remova o excesso de tampão assim como fez anteriormente. Coloque a lâmina novamente na câmara umidificada e incube com o anticorpo primário por uma hora, à temperatura ambiente.

Quando o tempo de incubação de uma hora terminar, coloque as lâminas novamente no porta-lâminas e lave com o tampão de lavagem por três vezes de 10 minutos. Após as lavagens, remova o excesso de tampão de lavagem ao redor da amostra com papel absorvente. Coloque as lâminas novamente na câmara umidificada e incube por uma hora à temperatura ambiente com o anticorpo secundário; após a incubação com o anticorpo secundário, lave em três mudanças de tampão de lavagem, por 15 minutos cada.

Em seguida, lavamos três vezes por cinco minutos. Em PBS, remova qualquer líquido em excesso ao redor do espécime e limpe o PBS do verso da lâmina para montar as lamínulas sobre a lâmina. Utilizamos móvel com DAB 2,5% co.

Para reduzir o desbotamento, adicione 80 microlitros gota a gota às lâminas. Tendo cuidado para não introduzir bolhas. Em seguida, abaixe lentamente uma lamínula.

Tendo o cuidado de não deixar bolhas. As bolhas são ruins porque frequentemente se formam exatamente sobre a sua amostra, justamente onde você deseja tirar suas imagens após a secagem do seu microscópio móvel. Agora você está pronto para observar suas lâminas.

Aqui está uma visão de uma coloração bem-sucedida utilizando um filtro FITC. Com uma objetiva de 20 x, observamos a claudina seis associada a todas as camadas basais superficiais da epiderme. Nosso laboratório tem grande interesse na expressão e na localização das claudinas na epiderme.

No que diz respeito às junções apertadas e à formação da barreira de permeabilidade epidérmica, acabamos de mostrar como realizar imunohistoquímica em pele de camundongo. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que você deseja que seus cortes de tecido estejam planos e que deve garantir que suas lâminas não sequem entre os períodos de incubação. Assim sendo, é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.