3D Agregação Stem Magnetic celular e biorreator Maturação para regeneração da cartilagem

O objetivo geral deste método de agregação magnética celular e maturação dinâmica é melhorar a condrogênese in vitro de células estromais mesenquimais ou CEMs. A agregação magnética de células-tronco em vez da condrogênese como condensação celular é uma etapa inicial fundamental do processo de regeneração da cartilagem. Após as células-tronco serem confinadas em scaffolds, os scaffolds podem ser transferidos para um biorreator celular para avaliar a maturação dinâmica das células.

O importante método dinâmico pode ser aplicado a outros biossistemas, como reparo muscular, cardíaco ou vascular. Mas, como você verá, ele é muito adequado para a regeneração da cartilagem. A demonstração visual do enxerto celular magnético e da maturação celular dinâmica utilizando o biorreator real é fundamental, pois essas duas técnicas são difíceis de aprender apenas com instruções textuais.

Para construir o dispositivo com micromagnetos para formação de agregados, insira primeiro uma ponta magnética de 750 micrômetros de diâmetro em cada orifício de três centímetros de profundidade em uma placa de alumínio com seis milímetros de espessura e posicione a placa sobre um ímã permanente de neodímio. Para construir um dispositivo para semeadura em suporte, corte primeiro o poliestireno rígido em quadrados de 2,4 centímetros quadrados e insira ímãs de três milímetros de diâmetro e seis milímetros de comprimento a uma distância igual sobre uma superfície de 1,6 centímetro quadrado. Em seguida, posicione o dispositivo sobre um ímã permanente de neodímio.

Para marcar as CMM humanas, primeiro cultive as células-tronco em meio completo de crescimento para CMM a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até atingirem 90% de confluência. Aspire e depois enxágue as células com meio RPMI Serum three sem glutamina, e adicione 10 mililitros de solução de nanopartículas de óxido de ferro por frasco de cultura de 150 centímetros quadrados para uma incubação de 30 minutos no incubador de cultura celular. Ao final da incubação, enxágue as células por cinco minutos com meio RPMI Serum three sem glutamina para internalizar as nanopartículas ainda ligadas à membrana plasmática.

Em seguida, substitua o RPMI em cada frasco por 25 mililitros de meio de crescimento completo para MSCs e retorne as células ao incubador de cultura celular durante a noite. Na manhã seguinte, desprenda as células magnéticas com oito mililitros de Tripsina-EDTA 0,05% por frasco e colete as células dissociadas por centrifugação.

Suspenderemos os pellets para contagem e colocaremos uma placa de Petri para cultivo celular de 35 milímetros com fundo de vidro sobre cada dispositivo magnético. Para formar os agregados magneticamente, adicione três mililitros de meio condrogênico a cada placa de Petri e deposite cuidadosamente no máximo oito microlitros de células marcadas a 2,5 vezes 10 à 5ª por agregado. É fundamental que as células sejam depositadas nem muito lentamente nem muito rapidamente.

Nem muito perto nem muito longe do magnetismo. Quando todos os agregados tiverem sido posicionados, deixe os esferoides se formarem por 20 a 30 minutos sem perturbação. Em seguida, transfira os agregados para a incubadora de cultura celular.

No mesmo dia, forme agregados por meio da centrifugação de 2,5 × 10⁵ células-tronco marcadas em tubos cónicos de 15 mililitros com 1,5 mililitro de meio condrogênico. Para semear magneticamente os andamios, coloque um andamio poroso de polissacarídeo pullulana/dextran seco por placa de Petri e dilua 2 × 10⁶ células marcadas em 350 microlitros de meio condrogênico sem TGFbeta3. Pipete cuidadosamente as células sobre os andamios e incube as estruturas a 37 °C para permitir a completa penetração celular.

Após cinco minutos, adicione cuidadosamente três mililitros de meio condrogênico à placa de Petri e retorne as estruturas ao incubador de cultura celular por quatro dias para permitir que as células migrem através dos poros da estrutura. No mesmo dia, semeie também outro conjunto de estruturas com 2 vezes 10 à 6ª potência de células-tronco marcadas, conforme demonstrado, e incube as células sem o ímã para obter estruturas uniformemente semeadas como controles positivos. Para a condrogênese nas estruturas no quinto dia, remova o dispositivo magnético de todas as estruturas e retorne as estruturas estáticas ao incubador de cultura celular até o dia 25, trocando o meio duas vezes por semana.

Para o cultivo celular dinâmico, também no quinto dia, corte o tubo de silicone no comprimento apropriado de acordo com as instruções do fabricante e coloque o tubo, a câmara de cultivo de 500 mililitros, os rotadores de dois sentidos e as gaiolas em uma cabine de segurança microbiológica estéril. Siga as instruções do fabricante para conectar o tubo aos rotadores de dois sentidos na câmara de cultivo. Em seguida, utilize uma espátula estéril para transferir cuidadosamente dois andamios celulares para cada gaiola.

Quando todas as estruturas forem transferidas, insira as gaiolas através das agulhas na tampa para impedir que se movimentem durante a rotação. Em seguida, preencha a câmara de cultura com meio condrogênico. Utilize técnica asséptica estéril ao preparar as câmaras para evitar contaminação de qualquer ferramenta ou estrutura.

Em seguida, insira as gaiolas na câmara, feche a câmara e ligue a bomba peristáltica para encher a tubulação com meio condrogênico e eliminar bolhas de ar. Posicione e fixe a câmara cheia no motor do biorreator e ligue o computador que controla as rotações do braço e da câmara. Em seguida, aplique uma velocidade de rotação de cinco rotações por minuto ao braço e à câmara, e ajuste a bomba peristáltica para uma taxa de fluxo de 10 rotações por minuto para alimentação contínua dos suportes celularizados.

Para gerar um constructo tridimensional em agregado livre de scaffolds no oitavo dia, inicie a fusão colocando dois agregados em contato em meio condrogênico para formar oito dupletas. Em seguida, no 11º dia, una duas dupletas para formar quatro quadrupletas e forme a estrutura final no 15º dia fundindo as quatro quadrupletas. Os tecidos formados por fusão magnética demonstram um aumento significativo na expressão de colágeno II em comparação com os pellets obtidos por centrifugação.

Com um aumento na tendência de expressão de agregantes. Para scaffolds estáticos celularizados, observa-se um aumento nas expressões de agregantes e colágeno II quando o semeadura magnética é utilizada, em comparação com o scaffold semeado sem forças magnéticas. Curiosamente, a expressão de colágeno II é muito maior quando a semeadura magnética é combinada com diferenciação dinâmica.

A análise histológica utilizando azul de toluidina revela que a fusão magnética sequencial de 16 agregados apresenta uma deposição abundante de glicanas de glicosamina. Além disso, em scaffolds semeados magneticamente, o teor de glicanas de glicosamina é maior quando os scaffolds são diferenciados em um biorreator do que quando são cultivados em condições estáticas. Após dominar a técnica, a agregação celular magnética pode ser concluída em duas horas, se realizada corretamente.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de ressuspender as células marcadas em um volume tão pequeno quanto possível para facilitar a formação de agregados. Após o semeadura magnética das estruturas, a maturação dinâmica utilizando o bioreator real pode ser realizada para melhorar a expressão de condrócitos recém-sintetizados. Desde o seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de medicina regenerativa explorarem a regeneração da cartilagem articular em humanos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como construir dispositivos magnéticos, marcar células-tronco a partir de agregados de células-tronco, semear escafandros magneticamente e utilizar um bioreator real. Não se esqueça de que trabalhar com células e tecidos humanos pode ser extremamente perigoso e que precauções sempre devem ser tomadas, como o uso de luvas, jalecos laboratoriais e óculos de proteção.