Detecção e enriquecimento da Rare células B antígeno-específica para a análise do fenótipo e função

O objetivo geral deste procedimento simples, porém eficaz, é isolar e enriquecer células B raras com ligação a antígenos a partir do sangue periférico humano utilizando nanopartículas magnéticas para sua análise fenotípica e funcional. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da imunologia sobre o fenótipo e a biologia de células B raras com ligação a antígenos, tanto antes quanto após o encontro com antígeno in vivo. A principal vantagem desta técnica é que ela elimina problemas associados à geometria, particularmente quando se utiliza uma placa de estireno ou uma esfera grande.

E elimina os problemas associados à taxa de fluxo ao isolar células por citometria de fluxo para obter células raras em populações celulares iniciais bastante grandes. Imediatamente após coletar de 30 a 50 mililitros de sangue total em tubos de coleta de sangue heparinizados, misture o sangue em uma proporção de 1:1 com PBS sem magnésio e sem cálcio, estéril e à temperatura ambiente. Em seguida, sobreponha a mistura de sangue sobre 10 mililitros de solução de gradiente de densidade à temperatura ambiente em um tubo cônico estéril de 50 mililitros, utilizando pressão lenta e constante no gatilho da pipeta.

Sequencie as células por centrifugação. Descarte a camada superior contendo plasma e plaquetas e use uma pipeta estéril para transferir o coágulo de células mononucleares, chamado de buffy coat, para um novo tubo estéril de 50 mililitros. Complete o tubo com até 50 mililitros de PBS para a lavagem das células mononucleares por centrifugação.

Em seguida, ressuspenda o pellet em 10 mililitros de PBS fresco para contagem e ressuspenda as células em uma concentração de 1x10^7 células por mililitro em PBS fresco sobre gelo. Para corar as células para ligação de microesferas magnéticas, transfira primeiramente alíquotas de 1-2x10^6 células para tubos de poliestireno de cinco mililitros para cada compensação de fluorescência e controle de Fluorescência Menos Um, conforme apropriado. Em seguida, colete o restante da amostra celular por centrifugação e ressuspenda o pellet em uma concentração de 3-6x10^7 células por mililitro em tampão FACS estéril filtrado e frio.

Divida igualmente a solução celular em quatro tubos FACS sobre gelo e adicione o reagente bloqueador de receptor Fcgama humano a essas quatro frações de amostra experimentais. Ao final da incubação de bloqueio da ligação inespecífica, adicione os anticorpos conjugados com fluorescência apropriados para marcação da superfície celular às células nas quatro frações de amostra. Em seguida, adicione o antígeno biotinilado apropriado às frações A e D, seguido pela adição de um volume suficiente de antígeno não marcado à fração B, de modo que a maioria dos receptores com afinidade de pelo menos 1x10^6 molar seja bloqueada.

Incube todas as amostras por 30 minutos no gelo, seguido por uma incubação de 30 minutos da fração B com o antígeno biotinilado apropriado. Ao final das incubações, lave as células duas vezes em um mililitro de tampão FACS frio por 5x10^7 células. E ressuspenda os pellets em um mililitro de formaldeído 2% por 5x10^7 células durante cinco minutos no escuro, no gelo.

Após a fixação, lave as células mais duas vezes conforme acabou de ser demonstrado. E ressuspenda os pellets em um mililitro de tampão FACS fresco e gelado por 5x10^7 células. Em seguida, marque as células com um a dois microgramas do anticorpo secundário conjugado com estreptavidina apropriado por 20 minutos no escuro e sob gelo, e lave as células mais duas vezes.

Para o enriquecimento baseado em nanopartículas magnéticas, re-suspenda as frações celulares A, B e C em um mililitro de Tampão de Separação frio por 5x10^7 células e filtre as células através de filtros individuais de 40 microlitros para eliminar quaisquer agregados. Em seguida, adicione as nanopartículas marcadas com corante fluorescente na concentração apropriada por 10 minutos no escuro a quatro graus Celsius com rotação e lave as amostras duas vezes em um mililitro de Tampão de Separação frio. Re-suspenda os pellets em um mililitro de Tampão de Separação frio por 5x10^7 células.

Em seguida, equilibre três colunas magnéticas em seus ímãs de tamanho apropriado com três mililitros de Tampão de Separação cada, permitindo que todo o volume do Tampão de Separação atravesse cada coluna e vá para um recipiente de resíduo. Agora, posicione um tubo cônico de 15 mililitros rotulado sob cada coluna e adicione as células marcadas com partículas magnéticas às suas respectivas colunas. Quando todo o volume de cada fração celular tiver passado por cada coluna, adicione três mililitros de Tampão de Separação fresco e gelado ao topo de cada coluna, coletando os efluentes nos tubos rotulados.

Após a segunda lavagem ter drenado completamente pelas colunas, coloque os tubos com as células negativamente selecionadas de cada fração no gelo e transfira as colunas para novos tubos de 15 mililitros para cada fração. Encha cada coluna com aproximadamente seis mililitros de Tampão de Separação fresco e, imediatamente, empurre o tampão pelas colunas para coletar as células ligadas magneticamente. Em seguida, colete tanto as frações positiva quanto negativa de células por centrifugação e ressuspenda os pellets na solução apropriada para a análise subsequente planejada.

Nestes gráficos, a frequência de células B reativas ao toxoide do tétano de um indivíduo que foi vacinado contra o tétano pela última vez há mais de uma década demonstra a capacidade deste método de enriquecer as células que se ligam ao toxoide do tétano aproximadamente sete vezes, com uma pureza de cerca de 4%. A adição de um excesso de 50 vezes de toxoide do tétano não marcado às células de um indivíduo vacinado cerca de três anos antes da coleta de sangue, antes da adição do antígeno biotinilado, reduz a ligação ao toxoide do tétano em 83%, demonstrando a especificidade da ligação ao antígeno. Quando o antígeno biotinilado é omitido do procedimento, apenas 0,2% das células B ainda se ligam, o que presumivelmente reflete a ligação de algum antígeno não relacionado ao tétano no agente absorvente.

Esses gráficos demonstram como a frequência de células B naïve específicas para toxoide tetânico, provenientes de uma amostra de sangue coletada sete dias após a vacinação de reforço de um indivíduo saudável, diminui de 84% para 64% após o reforço. Enquanto isso, a porcentagem das populações de memória e plasmablastos aumenta de 16% para 36% e de zero para 40%, respectivamente. Além disso, dados representativos de ELISPOT obtidos de uma amostra de sangue periférico coletada sete dias após o reforço em um indivíduo saudável ilustram o enriquecimento em quatro vezes na frequência de células secretoras de anticorpos contra toxoide tetânico observado nas células B isoladas que se ligam ao toxoide tetânico.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em cerca de três a quatro horas com todos os controles adequados. O método pode ser combinado com ensaios secundários, por exemplo, transferência de células para receptores adotivos para estudos subsequentes do destino e da função celular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar e enriquecer células B raras que se ligam a antígenos a partir do sangue periférico humano utilizando os controles adequados.