Um método de análise celular para o côndilo Mandibular murino e morfométricas

O objetivo geral deste experimento é observar os efeitos da carga compressiva na cartilagem condilar mandibular de camundongos usando medidas morfométricas em radiografias e análises histológicas. Essas métricas podem ajudar a responder a perguntas-chave sobre as mudanças estruturais e celulares no côndilo da mandíbula dos roedores. A principal vantagem da técnica mostrada aqui é que eles podem ser usados para analisar outros pequenos animais nascidos ou participantes.

Para este protocolo, ter mandíbulas de camundongo isoladas e dissecadas prontas para uso. Em uma placa de Petri, transfira as mandíbulas para um sistema de gabinete de raios-x. Em seguida, faça radiografias a 26 quilovolts por cinco segundos.

Agora, abra as imagens no software de análise para fazer medições morfométricas. Primeiro, use o botão da unidade para configurar a barra de escala. Em seguida, selecione seis pontos anatômicos usando o estilo de marcador 2.

Primeiro, selecione os pontos mais posteriores do côndilo mandibular como ponto um. Em seguida, selecione o processo incisivo para o ponto dois. Em seguida, selecione o ponto mais profundo no entalhe sigmóide para o ponto três.

Em seguida, selecione o ponto mais profundo da concavidade do ramo mandibular, ponto quatro e, em seguida, selecione o ponto mais anterior da superfície articular condilar, ponto cinco. Agora, selecione o ponto mais posterior da superfície articular condilar como ponto seis e prossiga com as medições de comprimento usando a ferramenta de comprimento. Em seguida, use a ferramenta de linha perpendicular dos pontos três a quatro para medir o comprimento da cabeça do côndilo, que é o comprimento da perpendicular, do ponto um até a linha entre os pontos três e quatro.

Em seguida, meça o comprimento mandibular, entre os pontos um e dois. Por fim, meça a largura da cabeça do côndilo, que está entre os pontos cinco e seis. Para salvar os dados, copie a lista de medidas no lado direito da tela.

Antes de incorporar as mandíbulas fixas, mas não descalcificadas, mergulhe-as durante a noite em sacarose a 30% em PBS. No dia seguinte, disseque qualquer excesso de tecido mole e corte cuidadosamente o côndilo mandibular. Agora, coloque as amostras em moldes de plástico, com a superfície medial do côndilo contra a base do molde e a amostra paralela ao fundo do molde.

Em seguida, mergulhe-os em resina embutida e resfrie a resina com um pedaço de gelo seco. Em seguida, complete os moldes com mais resina de incorporação. Transfira-os para dois metilbutano frios, resfriados por um freezer ou por gelo seco.

Depois de resfriados, armazene as amostras a 20 graus Celsius negativos ou a 80 graus Celsius negativos para seccionamento. Para quantificar a expressão de Col10a1 no CCM de cortes sagitais de côndilos, abra as imagens histológicas em um pacote de software de análise de imagem e selecione a área de interesse usando a ferramenta laço. Nesse caso, a região MCC é selecionada.

Anote o número de pixels na área, que é relatado na caixa de histograma. Em seguida, selecione os pixels vermelhos Col10a1 ajustando a faixa de cores. Use a ferramenta conta-gotas para selecionar um pixel vermelho da imagem e clique em OK. Em seguida, registre o número de pixels vermelhos na área, conforme relatado na caixa do histograma.

A fração de pixels vermelhos na área representa a quantidade de expressão Col10a1. Agora, usando a mesma técnica básica, quantifique a atividade do TRAP no MCC e no osso subcondral. Primeiro, selecione a cartilagem nas regiões ósseas subcondrais como as áreas a serem analisadas e anote o total de pixels.

Em seguida, selecione os pixels amarelos gerados pelo substrato ELF97. Anote o número de pixels positivos e calcule a fração de pixels positivos TRAP. Agora, quantifique as células positivas para EDU que são contra-coradas em azul por DEPI.

Novamente, selecione a área de interesse e quantifique os pixels azuis dentro dela. Use também esse método para determinar o número de pixels positivos EDU na mesma região. Medidas morfométricas de camundongos, submetidos à carga compressiva da ATM, mostraram que a carga aumentou significativamente o comprimento da cabeça da mandíbula e do côndilo.

No entanto, o carregamento não resultou em uma mudança significativa na largura do côndilo. A quantificação da distribuição de colágeno revelou um aumento significativo na expressão de Col10a1 e no MCC dos côndilos dos animais carregados. Por outro lado, a expressão de Col2a1 não foi muito diferente do controle.

A atividade de TRAP aumentou na região subcondral de côndilos e camundongos carregados, assim como a subproliferação. A coloração EDU denota o número de células proliferativas. A distribuição de proteoglicanos no CCM foi quantificada avaliando-se a área corada com azul de toluidina e o mapa de distância.

Houve um aumento significativo no mapeamento de distâncias no CCM dos côndilos do grupo carregado. No entanto, a área corada com proteoglicanos não foi estatisticamente diferente entre os grupos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como analisar as mudanças celulares e estruturais no côndilo mandibular de roedores.