PCR de fusão de alta resolução para receptor de complemento 1 polimorfismo de comprimento Genotípica: uma ferramenta inovadora para a avaliação da susceptibilidade genética da doença de Alzheimer
18 de julho de 2017
Aqui, descrevemos um método inovador para determinar os polimorfismos do comprimento do receptor 1 (CR1) do complemento para uso em várias aplicações, particularmente a avaliação da susceptibilidade a doenças como a doença de Alzheimer (AD). Este método poderia ser útil para entender melhor o papel das isoformas CR1 na patogênese da AD.
O objetivo geral deste método é genotipar polimorfismos de comprimento do receptor 1 do complemento para uso na avaliação da suscetibilidade a doenças, como a doença de Alzheimer, para entender melhor o papel das isoformas CR1 na patogênese da doença. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como a patogênese da doença de Alzheimer. As principais vantagens dessa técnica é que ela não requer amostras de sangue fresco e é mais fácil, barata, rápida e, portanto, aplicável a populações maiores.
Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando reconhecemos os desafios na realização de Western blots em relação ao tempo necessário e à necessidade de amostras de sangue frescas. Pipete 20 microlitros de proteinase K no fundo de um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione 200 microlitros de amostra ao tubo.
Adicione 200 microlitros de tampão de lise à amostra. Misture por vórtice de pulso por 15 segundos. Após a mistura, incubar a 56 graus Celsius durante 10 minutos em banho-maria.
Centrifugue brevemente o tubo de 1,5 mililitro para remover as gotas do interior da tampa. Em seguida, adicione 100 microlitros de etanol à amostra. Misturar novamente por vórtice de pulso durante 15 segundos antes de centrifugar brevemente o tubo como antes.
Em seguida, aplique cuidadosamente a mistura na coluna de membrana em um tubo de coleta de dois mililitros. Sem molhar a borda, feche a tampa e centrifugue a 6.000 vezes G por um minuto. Colocar a coluna de membrana num tubo de recolha limpo de dois mililitros e rejeitar o tubo que contém o filtrado.
Abra cuidadosamente a coluna de membrana e adicione 500 microlitros de tampão de lavagem sem molhar a borda. Fechar o tampão e centrifugar a 6 000 vezes G durante um minuto. Em seguida, colocar a coluna de membrana num tubo de recolha limpo de dois mililitros e rejeitar o tubo que contém o filtrado.
Depois de abrir cuidadosamente a coluna da membrana, adicione 500 microlitros de tampão de lavagem dois sem molhar a borda. Fechar o tampão e centrifugar a 20 000 vezes G durante três minutos. Em seguida, coloque a coluna de membrana em um novo tubo de coleta de dois mililitros e centrifugue novamente.
Após a centrifugação, colocar a coluna de membrana num tubo limpo de 1,5 ml e rejeitar o tubo de recolha que contém o filtrado. Abra cuidadosamente a coluna de membrana e adicione 200 microlitros de água destilada. Incubar a coluna à temperatura ambiente durante cinco minutos antes de centrifugar a 6 000 vezes G durante um minuto.
Para realizar o protocolo HRM-PCR, primeiro dilua as amostras de DNA em tubos de 1,5 mililitro com água até uma concentração de 10 nanogramas por microlitro. Em seguida, dilua as soluções de primer descongeladas em tubos de 1,5 mililitro com água até a mesma concentração de seis micromolares. Descongele as soluções do kit HRM-PCR e misture cuidadosamente por vórtice para garantir a recuperação de todo o conteúdo.
Gire brevemente os três frascos contendo mistura enzimática com corante de ligação ao DNA, cloreto de magnésio e água em uma microcentrífuga antes de abri-los. Em um tubo de 1,5 mililitro à temperatura ambiente, use os componentes para preparar a mistura de PCR para a reação de 120 microlitros, conforme descrito no protocolo de texto. Misture cuidadosamente por vórtice.
É fundamental que você trabalhe com atenção e aplicação de acordo com as boas práticas em biologia molecular. Pipete 19 microlitros da mistura de PCR em cada poço de uma placa branca de vários poços. Adicione um microlitro do molde de DNA ajustado à concentração e, em seguida, sele a placa branca de vários poços com folha de vedação.
Centrifugue a placa branca de vários poços por um minuto a 1.500 vezes G em uma centrífuga de balde oscilante padrão contendo um rotor para placas de vários poços com adaptadores adequados. Carregue a placa branca de vários poços no instrumento HRM-PCR. Inicie o programa HRM-PCR com as condições de PCR encontradas no protocolo de texto.
Após a reação HRM-PCR, realizar a análise HRM para determinar o polimorfismo de comprimento CR1 conforme descrito no protocolo de texto. As curvas de fusão foram analisadas usando o software após a fusão de alta resolução dos amplicons derivados de PCR do DNA genômico de indivíduos com diferentes isoformas CR1. Os resultados são curvas que discriminam os sujeitos de acordo com seus fenótipos alotípicos de expressão de CR1.
Conforme mostrado pelos dois modos de apresentação, curvas de fusão normalizadas e deslocadas e gráfico de diferença normalizado e com deslocamento de temperatura, os perfis de curva são distribuídos de acordo com a estrela CR1 três, CR1 estrela um grupo, CR1 estrela um, CR1 estrela dois grupo, CR1 estrela um grupo, CR1 estrela dois grupo e CR1 estrela dois, CR1 estrela quatro grupo. Essas curvas correspondem aos alelos do polimorfismo de comprimento CR1. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como genotipar facilmente o polimorfismo de comprimento CR1 de acordo com curvas perfeitas obtidas por HRM-PCR.
Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades devido à necessidade de amostras de referência de genótipos de comprimento CR1 já conhecidos. Quando dominada, essa técnica pode ser feita em quatro horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar a mesma concentração para cada amostra de DNA.
Após este procedimento, outros métodos, como o sequenciamento cônico de DNA, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a descoberta de um novo SNP privado conhecido. Após esse desenvolvimento, essa técnica abre caminho para pesquisas na área de genética populacional explorarem a pressão seletiva de patógenos no polimorfismo de comprimento CR1. Embora esse método possa fornecer informações sobre a suscetibilidade na patogênese da doença de Alzheimer, ele também pode ser aplicado a outros estudos de doenças, como lúpus eritematoso sistêmico e malária.
Visão Geral
Este artigo apresenta um novo método para genotipagem de polimorfismos de comprimento do receptor de complemento 1 (CR1), que pode auxiliar na avaliação da suscetibilidade a doenças como a doença de Alzheimer (AD). A técnica é vantajosa porque não exige amostras de sangue fresco e é mais eficiente para populações maiores.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Genética
- Patologia
Antecedentes
- As isoformas da CR1 estão implicadas na patogênese da doença de Alzheimer.
- Compreender os polimorfismos de comprimento da CR1 pode fornecer insights sobre a suscetibilidade à doença.
- Métodos tradicionais como o Western blot apresentam limitações, incluindo a necessidade de amostras frescas.
- Este método tem como objetivo superar esses desafios.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para genotipagem de polimorfismos de comprimento no CR1.
- Avaliar a relação entre isoformas do CR1 e a suscetibilidade à doença de Alzheimer.
- Facilitar pesquisas em genética de populações relativas a polimorfismos no CR1.
Métodos Utilizados
- Preparação da amostra usando proteinase K e tampão de lise.
- PCR de fusão de alta resolução (HRM-PCR) para genotipagem.
- Análise das curvas de fusão para discriminar fenótipos de expressão de CR1.
- Aplicação do método a diversos estudos de doenças além do Alzheimer.
Resultados Principais
- O método permite a genotipagem eficiente de polimorfismos de comprimento no CR1.
- Os resultados mostram perfis distintos de curva de dissociação correspondentes a diferentes alelos do CR1.
- Aplicabilidade demonstrada em populações maiores sem necessidade de amostras frescas.
- Potencial para pesquisas futuras em outras doenças, como lúpus eritematoso sistêmico e malária.
Conclusões
- Este método inovador aprimora a compreensão do papel do CR1 na doença.
- Oferece uma abordagem prática para estudos genéticos em larga escala.
- Aplicações futuras poderiam expandir-se para diversas doenças influenciadas por polimorfismos no CR1.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A genotipagem de polimorfismos de comprimento do receptor 1 do complemento (CR1) permite a redução de riscos mecanicistas na validação de alvos em doenças de Alzheimer, associando a expressão de isoformas às vias de eliminação do peptídeo beta-amilóide. Este método de PCR por análise de fusão de alta resolução fornece confiança preditiva para a investigação de hipóteses terapêuticas sem necessidade de amostras frescas, apoiando triagens escaláveis em estudos de genética populacional. A abordagem melhora a continuidade translacional da descoberta até a avaliação pré-clínica da suscetibilidade à doença mediada pelo CR1.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas por meio da correlação entre polimorfismo no comprimento do CR1 e a capacidade de fagocitose do peptídeo beta-amilóide.
- Valor Operacional: Permite a desmistificação biológica de alvos mediados pelo complemento utilizando DNA arquivado, reduzindo a dependência de biosseguros frescos.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao quantificar a distribuição de isoformas associadas à regulação alterada do sistema complemento em vias neurodegenerativas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Produz razões quantitativas de curvas de HRM que discriminam alelos do CR1 para genotipagem confiável em grandes coortes.
- Valor Operacional: Padroniza a detecção de amplicons por meio da comparação de fragmentos invariáveis e variantes, garantindo reprodutibilidade entre laboratórios.
- Escalabilidade: Aplicável a estudos em escala populacional devido ao baixo custo, requisitos mínimos de entrada e compatibilidade com plataformas de PCR de alto rendimento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Translacional: Conecta a genotipagem de isoformas de CR1 a mecanismos fisiopatológicos na doença de Alzheimer e outras condições imunomediadas.
- Continuidade Pré-clínica: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco ao estratificar modelos com base em perfis de polimorfismo de comprimento de CR1.
- Redução de Riscos Mecanística: Esclarece o potencial de interação com o alvo ao identificar indivíduos com eliminação alterada de peptídeos patogênicos mediada por CR1.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos promissores, ao fornecer coortes geneticamente definidas para triagem mecanicista e alinhamento de biomarcadores.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre o papel do CR1 na eliminação de complexos imunes e nas vias de neuroinflamação.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis para avaliação do efeito de compostos em amostras estratificadas por CR1.
- Análises: Gera medições de razão derivadas de HRM que permitem comparação estatística de associações genótipo-fenótipo.
- Pesquisa Translacional: Conecta a estratificação genética à validação pré-clínica de terapêuticas direcionadas ao sistema complemento somente quando respaldado pelo material de origem.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de genotipagem reutilizável aplicável a múltiplas áreas de doenças além do Alzheimer, incluindo distúrbios infecciosos e autoimunes.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da ligação mecanicista de isoformas de CR1 à patogênese da doença.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade possibilitadas pela HRM-PCR em tubo fechado e processamento mínimo de amostras.
- Valor Estratégico: Decisões de avanço ou interrupção aprimoradas por meio da redução da incerteza biológica no engajamento do alvo e na modulação da via.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco de candidatos moduladores do sistema complemento com base em perfis de suscetibilidade geneticamente definidos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em otimização de PCR e análise de curvas de dissociação de alta resolução.
- Depende do acesso a instrumentação compatível com HRM e genótipos de referência validados para chamada precisa de alelos.
- É necessário padronizar entre equipes os protocolos de quantificação de DNA e diluição de iniciadores para garantir consistência entre laboratórios.
- As considerações para adaptação incluem a validação em diversos tipos de amostras (por exemplo, sangue, saliva), mantendo proporções consistentes de amplicons.
- Limitação prática: a precisão do método depende da disponibilidade de amostras de referência com genótipos de comprimento do CR1 conhecidos para interpretação das curvas.
