Reconstrução tridimensional da arquitetura Vascular do ovário passiva Mouse clareza-limpo
10 de dezembro de 2017
Aqui apresentamos uma adaptação do método de reconstrução 3D para visualização da vasculatura do ovário e capilares foliculares e clareza passiva em ovários intactos do mouse.
O objetivo geral deste protocolo é fornecer uma visão tridimensional completa da distribuição capilar em folículos ovarianos de camundongos e mostrar suas relações. O ovário é um órgão essencial na reprodução e na endocrinologia. Conte cada estágio de desenvolvimento diferente do folículo e das células somáticas.
Além disso, ao contrário de outros órgãos, o ovário não apresenta a ramificação repetida da unidade funcional. O sistema vascular local pode estar junto com o sistema nervoso também são capazes de sofrer grandes mudanças em cada ciclo menstrual em mulheres adultas. A aplicação da clareza passiva no ovário nos permite ver a distribuição geral e a conexão entre essas células e folículos no ovário.
A maior parte da chave dessa medida é que ela tem o menor efeito sobre o ovário e é responsável pela limpeza de vários marcadores. Através da reconstrução da imagem microscópica, fornecemos um mapa do ovário. Alguns detalhes dos vasos, neurônios e folículos podem ser observados claramente.
Para análise de imagens, algumas opções de Imaris foram utilizadas para avaliar as relações entre o ovário e as estruturas. Prepare soluções de profusão de acordo com as instruções do artigo e mantenha-as no gelo. Anestesie os ratos e certifique-se de que o mouse não tenha resposta de beliscão do dedo do pé.
Pulverize etanol, faça uma incisão no átrio direito e, em seguida, profusa instantaneamente o ventrículo esquerdo com 20ml de PBS gelado na velocidade de 10ml por minuto para eliminar o sangue. Em seguida, profusa o animal com solução de hidrogel fria com a mesma velocidade. Colete os ovários, bem como o útero, para manter a integridade da morfologia ovariana.
Transfira os ovários separados para a solução de hidrogel fria. Sob um microscópio estéreo, remova os tecidos adiposos ao redor do ovário. Para melhor resultado da fixação tecidual, recomendamos a remoção da bursa ovariana.
Mantenha os ovários em solução de hidrogel por três dias. Após três dias, transfira os ovários para um tubo de vidro e encha o tubo com solução de hidrogel fresca. Estique o parafilme sobre a parte superior do tubo e, em seguida, enrole outro parafilme ao redor do gargalo do tubo.
Certifique-se de que não haja bolhas entre o parafilme e a solução de hidrogel. Coloque o tubo de vidro em uma incubadora agitadora a 37 graus centígrados por duas horas até que o gel se forme. Remova cuidadosamente o excesso de gel ao redor dos ovários com um filtro de papel.
Coloque os ovários em um tubo de 15ml e encha o tubo com 10ml de solução de limpeza. Coloque o tubo em uma incubadora agitadora a 37 graus centígrados por pelo menos dois meses. Troque a solução de limpeza todos os dias nos primeiros três dias e depois semanalmente até que o ovário seja limpo.
Todos os procedimentos de imunocoloração são feitos a 37 graus centígrados em um agitador. Primeiro, lave o ovário em PBST por 24 horas. Segundo ovário incubado em anticorpo primário diluído por PBST por dois dias.
Terceiro, lave os anticorpos primários com tampão PBST. Quarto, incube o ovário com o anticorpo secundário desejado em PBST por dois dias. Quinto, lave os anticorpos secundários com PBST.
Sexto, transfira o ovário para uma solução de correspondência de índice de refração para homogeneização de IR. Verifique a transparência visual, quando o ovário estiver totalmente esclarecido, ele poderá ser fotografado. Primeiro, prepare um prato com fundo de vidro limpo.
Faça um cilindro de massa e molde-o em forma de ferradura. Pressione a borda externa firmemente na corrediça de vidro para criar um espaço selado. A altura da massa deve ser um pouco mais alta que o ovário.
Mova o ovário com cuidado para o centro e adicione a solução de montagem. Empurre um prato sobre a massa e use dois pedaços de massa para consertá-lo. Quando o ovário estiver pronto para a imagem, o microscópio confocal Nikon com lente 16X pode ser selecionado para obter a imagem.
Para imagens com microscópio confocal, primeiro escolha a lente no painel Ni-E. No painel aquisição, selecione o número de canais. Primeiro, use a guia Eye Port e o joystick do controlador XY para mover o tecido para o centro do campo por meio da verificação por oculares de microscópio.
Em segundo lugar, depois de desligar a luz do obturador, clique na guia ao vivo para ajustar a potência do laser, HV e deslocamento para cada canal. No painel Correção de intensidade Z ajuste a aquisição para a camada superior, clique no botão de adição para definir a parte superior, mova a lente para baixo e defina a potência apropriada de HV e laser para a parte inferior do tecido e adicione as informações da camada mais baixa, clique em Para ND para sincronizar a configuração com o painel e a aquisição. E na aquisição, primeiro defina o número de etapas de verificação.
Clique nas guias de Z e imagem grande. Em segundo lugar, vá para a janela de imagem grande de varredura para definir o tamanho do campo de acordo com a borda do tecido. Terceiro, de volta à aquisição ND para inserir o tamanho dos campos de digitalização e escolher a sobreposição entre 10 e 50%Em seguida, clique em executar correção Z e aguarde o processo de imagem.
Primeiro use o imagic para abrir o arquivo NIS original. Clique no botão de imagem, escolha os canais de cor e exibição, clique em arquivo, escolha as sequências de imagens e salve-as separadamente como arquivos tiff. Em segundo lugar, use o Imaris para abrir um dos arquivos tiff.
Clique no botão editar e escolha adicionar canais para adicionar o restante. O nome e a cor podem ser alterados no ajuste do visor. A espessura do tecido também deve ser corrigida nas propriedades da imagem.
Terceiro, clique no botão editar e escolha Crop 3D para cortar a parte extra. Primeiro, clique no botão de filamento e clique em próximo. Vá para o painel de fatias, encontre um recipiente de rastreamento e distância, depois volte para o Surpass, insira a estática e clique em próximo.
Em segundo lugar, ajuste o limite inicial e o ponto de ajuste. No painel da câmera, escolha a seleção, pressione shift e clique no ponto para remover a parte extra. Terceiro, escolha o limite mais alto e clique em Avançar.
Não selecione pontos de detecção e vá em seguida. Algumas peças em excesso podem ser removidas no painel de edição. A cor pode ser editada clicando na cor.
A arquitetura 3D da vasculatura ovariana foi investigada após a imunomarcação de CD31. A estrutura 3D pode ser observada por fatias através de outras fatias ou por totalidade através da renderização de volume. CD 31 é a coloração da vasculatura folicular de camundongos adultos.
Através da reconstrução dos capilares pelos filamentos, pudemos mostrar a relação entre os folículos individuais e seus capilares. O ovário, como uma mulher, está sempre ativo e intercambiável. No entanto, devido à limitação da análise histológica tradicional, é muito difícil descrever as relações entre esses constituintes complexos.
O método recém-desenvolvido, a clareza passiva pode nos ajudar a superar o obstáculo óptico, manter a integridade de todos os tecidos e fornecer as pistas funcionais.
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Visão Geral
Este estudo apresenta uma adaptação do método CLARITY passivo para a visualização da vasculatura ovariana e dos capilares foliculares em ovários de camundongos intactos. O protocolo tem como objetivo fornecer uma visão tridimensional abrangente da distribuição dos capilares dentro dos folículos ovarianos.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia Reprodutiva
- Biologia Vascular
Contexto
- O ovário desempenha um papel fundamental na reprodução e na endocrinologia.
- Os folículos passam por diversas fases de desenvolvimento, cada uma com células somáticas distintas.
- Diferentemente de outros órgãos, o ovário não apresenta ramificação repetida de unidades funcionais.
- O sistema vascular no ovário pode mudar significativamente durante cada ciclo menstrual.
Objetivo do Estudo
- Visualizar a distribuição geral dos capilares nos folículos ovarianos de camundongos.
- Ilustrar as relações entre células e folículos dentro do ovário.
- Ampliar a compreensão da vascularização ovariana e suas implicações para a saúde reprodutiva.
Métodos Utilizados
- Aplicação da técnica passiva CLARITY.
- Reconstrução tridimensional da vasculatura ovariana.
- Visualização de capilares foliculares em ovários de camundongos intactos.
- Contagem de diferentes estágios de desenvolvimento de folículos e células somáticas.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida de redes capilares em folículos ovarianos.
- Mapeamento detalhado das conexões vasculares entre folículos.
- Compreensão das mudanças dinâmicas na vasculatura ovariana.
- Estabelecimento de uma estrutura para futuros estudos sobre biologia ovariana.
Conclusões
- O método passivo CLARITY revela efetivamente a arquitetura vascular ovariana.
- Essa abordagem pode aprimorar nosso entendimento da função e saúde ovarianas.
- Pesquisas futuras podem se basear nesses achados para explorar a endocrinologia reprodutiva.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Visualizar a vasculatura ovariana intacta em 3D permite reduzir mecanicamente os riscos associados a hipóteses sobre alvos reprodutivos, esclarecendo as relações estruturais entre folículos e suas redes capilares. Esta abordagem reforça a confiança preditiva na fase inicial de descoberta, fornecendo leituras quantitativas e reprodutíveis da arquitetura vascular que podem orientar a validação de alvos e os fluxos de trabalho de triagem fenotípica. O método aborda um desafio-chave na fase de descoberta: vincular o contexto anatômico à biologia ovariana funcional sem distorção tecidual.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao mapear o comprimento dos capilares foliculares em relação ao volume da parede folicular, apoiando a validação funcional de alvos.
- Valor Operacional: Fornece um protocolo padronizado de clareamento com mínima retração que preserva a integridade do tecido para análise vascular reprodutível.
- Valor Preditivo: Facilita a redução de riscos biológicos por meio de dados quantitativos de correlação (P<0,01) entre a extensão capilar e o desenvolvimento folicular.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera mapas vasculares tridimensionais validados que servem como sistemas relevantes para doenças na avaliação dos efeitos de compostos na microestrutura ovariana.
- Valor Operacional: Permite a padronização de ensaios por meio de parâmetros consistentes de imunomarcação (CD31), clareamento e aquisição de imagens em folículos.
- Escalabilidade: Apoia a reutilização da plataforma por meio de fluxos de trabalho adaptáveis de clareamento e reconstrução, aplicáveis a outros tecidos endócrinos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta fenótipos vasculares em estágio de descoberta a modelos pré-clínicos, preservando a arquitetura ovariana nativa para estudos longitudinais.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece as interações neurovasculares no ovário, reduzindo ambiguidades nas vias endócrinas-alvo.
- Avanço Ajustado ao Risco: Fornece biomarcadores estruturais (por exemplo, comprimento capilar, volume folicular) para orientar decisões de avanço ou interrupção em programas de modulação folicular.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta ao permitir a análise orientada por hipóteses das contribuições vasculares para a maturação folicular, apoiando a identificação de compostos promissores por meio de perfilhamento fenotípico vascular e orientando a validação pré-clínica por meio de fenotipagem de tecidos intactos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre reguladores vasculares no desenvolvimento folicular por meio da visualização direta tridimensional das redes capilares.
- Triagem: Fornece tecido ovariano transparentizado e pronto para ensaio, com saídas vasculares quantitativas, para campanhas de triagem de compostos.
- Análise: Fornece medidas morfométricas (comprimento capilar, volume folicular) e estatísticas de correlação para permitir análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Mantém a fidelidade histológica do estágio de descoberta até as fases pré-clínicas, evitando artefatos provocados pelo corte de tecidos.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade de mapeamento vascular reutilizável para atlas de tecidos endócrinos e reprodutivos em diversos projetos de descoberta.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista na biologia vascular ovariana.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e padronização entre laboratórios por meio da mínima perturbação tecidual proporcionada pelo CLARITY passivo.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência de capital ao permitir a detecção precoce de fenótipos foliculares relacionados à vasculatura, reduzindo a perda em estágios tardios.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos com base em fenótipos vascular-estruturais em coortes foliculares.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em clareamento de tecidos baseado em hidrogel, imunomarcação e microscopia confocal multiphoton.
- Depende de instrumentação especializada, incluindo incubadoras com agitação, sistemas de casamento de índice de refração e software de reconstrução 3D (por exemplo, Imaris).
- Necessita padronização entre equipes quanto ao tempo de clareamento, validação de anticorpos e parâmetros de imagem para quantificação reprodutível dos vasos sanguíneos.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o protocolo a tecidos não ovarianos, devido às diferenças em densidade e teor lipídico.
- É limitado pelo longo tempo de clareamento (até dois meses) e pela necessidade de otimização da penetração de anticorpos em regiões estromais densas.
